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输卵管特异性表达γ-IFN的转基因鸡初探

2020-12-08阅读(559)

输卵管特异性表达γ-IFN的转基因鸡初探

论文摘要

目的:随着转基因技术的不断进步,转基因动物的研究也不断取得新的进展。目前使用常规的转基因生物（如细菌、昆虫等）生产糖基化药用蛋白的生产能力受到很大的限制,利用转基因动物生物反应器生产糖基化药用蛋白的研究逐渐成为研究热点。转基因鸡输卵管生物反应器具有世代周期短、饲养成本低、繁殖快和产量高的优点,使其成为生产药用蛋白的理想选择。输卵管特异性表达的目的蛋白最终在鸡蛋蛋清中表达,而且蛋清中卵清蛋白含量高、组分比较简单,有利于目的蛋白的分离与纯化。以上诸多优点使鸡输卵管生物反应器在生物制药领域拥有良好的应用前景。本研究的目的是通过PiggyBac转座子载体介导的方法将γ-hIFN目的基因整合到鸡的基因组中,最终获得输卵管特异性表达γ-hIFN的转基因鸡。方法:（1）本研究首先根据前人的研究经验,结合本实验室的条件对鸡胚换壳培养体系进行了探索,建立稳定的鸡胚换壳培养操作流程,并对鸡胚盘下腔注射体内感染复合物的注射量进行对比实验,寻找最佳的注射量;（2）利用实验室己构建的pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和pLenti6.4-CMV-EGFP载体分别转染HEK 293T细胞和原代鸡输卵管上皮细胞验证cERE/cOVP启动子的活性;（3）以实验室保存的pLenti6.4-CMV-γ-hIFN、pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和PUC57-P2A-RFP载体为模板,分别扩增cERE/cOVP、y-hIFN片段和P2A-RFP片段,通过重叠PCR将γ-hIFN片段和P2A-RFP片段连接起来构建表达盒。然后将cERE/cOVP和γ-hIFN-P2A-RFP片段分别亚克隆至无启动子的PB002G转座子载体Nhel/Mfel和AscI酶切位点之间,构建特异性表达载体PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,并将γ-hIFN-P2A-RFP表达盒克隆至PB-dual-promotor转座子载体的Mfel与Nhel酶切位点之间构建PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP表达载体,将PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP分别转染HEK 293T细胞和原代鸡输卵管上皮细胞,检测γ-hIF N和RFP表达。（4）利用in-vivo jetPEI转染试剂,将PB002G-cER E/cOVP-y-hIFN-P2A-RFP和PBase转座酶质粒进行X期鸡胚胚盘下腔注射,孵化到第14天取鸡胚组织器官提取基因组DNA,PCR检测目的基因在鸡胚的基因组中的整合情况。结果:（1）胚盘下腔显微注射注射量为2.5ul最为合适。（2）p Lenti6.4-cERE/cOVP-EGFP转染细胞后,cERE/cOVP启动子能够成功启动EGFP在HEK 293T细胞和鸡原代输卵管上皮细胞中表达,说明该启动子能够发挥启动功能。（3）成功构建了 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-Dual-CMV-y-hIFN-P2A-RFP转座子载体,分别转染HEK 293T细胞和鸡原代输卵管上皮细胞,通过显微镜观察荧光表达、RT-PCR、细胞免疫荧光和Western Blot检测到了 y-hIFN和RFP基因的表达。（4）对45枚种蛋进行鸡胚盘下腔注射转座子载体PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,孵化14天后鸡胚存活17枚,存活率为37.78%,取鸡胚的心脏和性腺组织提取基因组DNA,进行PCR检测目的基因整合效率,最终在4个鸡胚心脏组织、2个性腺组织DNA样本中检测到了γ-hIFN基因的整合,其中1个样本在心脏和性腺组织DNA中同时检测到了γ-hIFN基因的整合。本研究初步证明了转座子载体能够介导γ-hIFN[基因整合至鸡胚基因组,为PiggyBac转座子介导输卵管特异性表达γ-hIFN转基因鸡研究奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩写符号说明
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 转基因鸡的研究进展
  •   1.2 转基因鸡的制备
  •     1.2.1 外源基因受精卵显微注射
  •     1.2.2 逆转录病毒介导的转基因
  •     1.2.3 慢病毒介导的转基因
  •     1.2.4 转座子介导的转基因
  •   1.3 鸡胚换壳培养体系
  •   1.4 鸡输卵管生物反应器的研究进展
  •     1.4.1 卵清蛋白的简介及表达调控
  •     1.4.2 卵清蛋白基因的结构
  •     1.4.3 卵清蛋白启动子
  •     1.4.4 输卵管特异性表达转基因鸡的研究现状
  •   1.5 г-干扰素（г-IFN）的研究进展
  •   1.6 本研究的目的与意义
  •   1.7 实验路线
  • 第二章 鸡胚盘下腔显微注射与换壳培养体系条件的探索与优化
  •   2.1 前言
  •   2.2 材料和方法
  •     2.2.1 材料
  •     2.2.2 实验设备
  •   2.3 非注射鸡胚换壳培养
  •   2.4 不同注射量对孵化率的影响
  •   2.5 结果
  •     2.5.1 非注射鸡胚换壳培养
  •     2.5.2 不同注射量的鸡胚换壳
  •   2.6 讨论
  •   2.7 小结
  • 第三章 鸡卵清蛋白启动子的活性验证及γ-hIFN转座子载体构建
  •   3.1 前言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 实验材料
  •     3.2.2 主要试剂
  •     3.2.3 实验仪器设备
  •     3.2.4 常用试剂的配制
  •   3.3 启动子活性验证
  •     3.3.1 HEK 293T细胞转染
  •     3.3.2 鸡原代输卵管上皮细胞的转染
  •   3.4 г-IFN转座子载体的构建
  •     3.4.1 cERE/cOVP引物的设计与合成
  •     3.4.2 cERE/cOVP片段扩增
  •     3.4.3 PCR产物的回收与纯化
  •   3.5 г-HIFN片段和P2A-RFP片段的克隆
  •     3.5.1 γ-hIFN片段和P2A-RFP片段引物设计与合成
  •     3.5.2 γ-hIFN片段和P2A-RFP片段的PCR扩增
  •     3.5.3 PCR产物的回收与纯化
  •   3.6 重叠延伸PCR拼接г-HIFN和P2A-RFP
  •     3.6.1 γ-hIFN-P2A-RFP聚合酶链式反应
  •     3.6.2 γ-hIFN-P2A-RFP融合片段与pMD-18T载体连接
  •     3.6.3 连接产物的转化
  •     3.6.4 菌液PCR筛选阳性克隆
  •     3.6.5 阳性质粒的小量抽提
  •     3.6.6 阳性质粒的酶切鉴定及测序
  •   3.7 转座子载体的构建
  •     3.7.1 γ-hIFN-P2A-RFP片段与载体的酶切
  •     3.7.2 目的片段与载体的连接
  •     3.7.3 连接产物的转化
  •     3.7.4 阳性菌落的筛选
  •     3.7.5 阳性质粒的小量提取
  •     3.7.6 阳性质粒的酶切鉴定与测序
  •     3.7.7 阳性重组质粒的中提
  •     3.7.8 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP的第二步构建
  •   3.8 结果
  •     3.8.1 cERE/cOVP启动子活性验证
  •     3.8.2 cERE/cOVP启动子的扩增
  •     3.8.3 γ-hIFN和P2A-RFP片段的扩增
  •     3.8.4 重叠PCR拼接γ-hIFN和P2A-RFP片段
  •     3.8.5 pMD-18T-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒的酶切鉴定
  •     3.8.6 γ-hIFN-P2A-RFP片段的测序结果
  •     3.8.7 PB-dual-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒的菌液PCR筛选及双酶切鉴定
  •     3.8.8 PB-dual-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒测序
  •     3.8.9 PB002G-γ-hIFN-P2A-RFP连接阳性菌落筛选及双酶切鉴定
  •     3.8.10 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定
  •     3.8.11 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP特异性转座子表达载体的测序
  •   3.9 讨论
  •   3.10 小结
  • 第四章 γ-hIFN转座子表达载体的体外验证及体内表达
  •   4.1 前言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 实验材料
  •     4.2.2 主要试剂
  •     4.2.3 实验仪器设备
  •     4.2.4 常用试剂的配制
  •   4.3 转座子载体的体外验证
  •     4.3.1 细胞转染
  •     4.3.2 RT-PCR检测
  •     4.3.3 Western Blot检测γ-hIFN蛋白
  •   4.4 特异性转座子表达载体的体内表达
  •     4.4.1 特异性转座子表达载体鸡胚盘下腔注射
  •     4.4.2 14日龄鸡胚组织DNA提取
  •     4.4.3 目的基因的检测
  •   4.5 结果
  •     4.5.1 PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP转座子载体的体外验证
  •     4.5.2 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP特异性转座子载体的体外验证
  •     4.5.3 特异性转座子载体体内感染
  •   4.6 讨论
  •   4.7 小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 攻读学位期间发表论文情况

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 徐闰

    导师: 郑喜邦

    关键词: 鸡胚换壳培养,卵清蛋白启动子,转座子载体,转基因鸡

    来源: 广西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 广西大学

    分类号: Q78;S831

    总页数: 90

    文件大小: 8741K

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