论文摘要
研究背景:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是严重影响人类健康的全球性公共卫生问题。全世界有超过3.5亿人成为慢性HBV携带者。这一人群有更高的肝硬化和肝癌发病风险,每年超过100万人因此死亡。患者生活质量下降,预期寿命缩短。临床上治疗慢性HBV感染的药物主要有两大类:一类为抗病毒治疗药物,如核苷类药物;另一类为免疫治疗药物,如α-干扰素（IFN-α）。这些治疗药物存在种类少、高耐药、低耐受、难以彻底清除病毒、停药后易复发、不良反应多等诸多问题。接种乙型肝炎疫苗（HepB）是当前防控HBV感染最好的方法。我国自从1992年实施新生儿HepB预防接种策略以来成效显著,儿童乙肝发病率、HBV携带率有了明显的下降。但HepB应用中,一些不足也暴露出来。现有HepB为重组亚单位疫苗,免疫原性弱,需要添加铝佐剂。铝佐剂HepB需要进行三次免疫才能诱导产生有效的预防效果,耗时长、操作不利、易出现漏种。这在一定程度上限制了其有效推广。并且,铝佐剂HepB仅能够诱导体液免疫,诱导特异性抗体的产生。接种现有铝佐剂HepB尚有大约5-10%的人群不能有效产生抗体,仍然存在高HBV感染风险。因此,有效诱导CD8+T细胞免疫与B细胞免疫可以获得比现有疫苗体液免疫更高级的免疫保护。而且,越来越多铝佐剂相关的副作用被报道,例如无菌性脓肿、嗜酸性粒细胞增多、肌筋膜炎、肉芽肿形成和阿尔茨海默氏病等。因此,对现有HepB进行改良是非常必要的。在过去的十几年中,纳米技术在疫苗学中的应用呈指数增长,已形成了纳米疫苗学（nanovaccinology）。纳米制剂可从多个角度发挥免疫促进作用,促进抗原特异性免疫、免疫记忆诱导。另外,纳米制剂可以改变疫苗给药途径、给药方法、给药次数等,从多方面改良现有疫苗制剂。纳米凝胶（nanogel,Ng）性质稳定,易制备,具有高含水量、高荷载能力。CS为天然来源的正电荷多糖化合物,无毒、生物可降解、无免疫原性,是广泛应用的药剂敷料。γ-PGA是天然存在的水溶性、生物可降解、无毒化合物。CS与γ-PGA有望制备高HBsAg载量纳米凝胶,促进HBsAg疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫。另外,铝佐剂HepB不能有效诱导抗原特异性细胞免疫,一个重要的原因是铝佐剂会抑制DCs的白细胞介素12（interleukin-12,IL-12）分泌。IL-12能够显著促进NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞产生大量的IFN-γ,介导细胞免疫应答。也可以与B细胞相互作用,促进B细胞分化以及抗体产生。因此,IL-12对细胞免疫和体液免疫有明显的促进作用。但是IL-12价格昂贵且易发生不良反应。IL-12质粒（pIL-12）结构稳定,相对容易构建,易于大规模生产。纳米凝胶可以提高pIL-12体内稳定性和转染效率。pIL-12有望作为佐剂用于HBsAg疫苗。研究目的:研究分两部分,分别观察了纳米凝胶能否作为HBsAg载体增强HBsAg疫苗免疫效果,以及pIL-12是否可以作为佐剂提高HBsAg疫苗免疫效果。研究方法:1.利用CS、γ-PGA分别制备HBsAg纳米凝胶及pIL-12纳米凝胶,对纳米凝胶进行理化性质考察。2.取C57BL/6J小鼠分别腿部肌肉注射不同制剂免疫,定时取外周血测定anti-HBs水平,观察不同制剂、不同免疫方案对免疫效果影响。3.对不同免疫方案C57BL/6J小鼠尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2质粒进行攻击,定时测定攻击后小鼠血清HBsAg、anti-HBs水平,评价不同制剂免疫小鼠抗HBV感染能力。4.分别取肝脏、脾脏、淋巴结、外周血,提取淋巴细胞,进行流式细胞术测定免疫细胞比例、绝对数及细胞因子表达,评价不同免疫方案对小鼠免疫功能、免疫记忆的影响。研究结果:一、单剂量正电荷HBsAg纳米凝胶诱导长效免疫防御HBV感染的作用及机制研究1.调整CS与y-PGA 比例与加入顺序,可分别获得正电荷与负电荷纳米凝胶。正、负电荷纳米凝胶对HBsAg均有很好包封效率。2.HBsAg Ng（+）、HBsAg Ng（-）、市售乙肝疫苗三次免疫均能获得高水平anti-HBs表达,pAAV/HBV1.2质粒攻击后能够迅速清除病毒,恢复抗体表达,很好地预防HBV感染。3.单次免疫,仅HBsAg Ng（+）能够快速诱导HBsAg特异性抗体产生,对HBV感染发挥有效免疫防御作用,pAAV/HBV1.2质粒攻击后能够有效清除HBV感染、恢复抗体表达。HBsAg Ng（+）有望成为现有市售铝佐剂疫苗的改进。4.HBsAg Ng（+）能够促进DCs的成熟,并促进pAAV/HBV1.2质粒攻击后细胞免疫。与对照组相比,HBsAg Ng（+）组IFN-γ+CD8+T细胞比例显著上调、效应记忆T细胞比例显著增加。单剂量HBsAg Ng（+）免疫可以获得长效抗HBV感染保护。5.HBsAg Ng（+）、HBsAg Ng（-）三次免疫治疗CHB均可以显著促进HBsAg清除,增加IFN-γ+CD8+T细胞比例,但未观察到HBV特异性抗体产生。二、负电荷纳米凝胶荷载IL-12表达载体作为HBsAg疫苗佐剂诱导防御HBV感染免疫应答作用的研究1.研究采用诱导抗体水平较高的Ng（-）（pIL-12）进行。Ng（-）（pIL-12）对pIL-12有很好包封效率,肌肉注射能够有效促进IL-12分泌,增加小鼠血清IL-12p70水平。2.Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫效果具有剂量相关性。高剂量Ng（-）（pIL-12）（75 μg）佐剂联合HBsAg疫苗三次免疫能够有效诱导anti-HBs表达,但是可能不利于HBsAg疫苗免疫后细胞免疫诱导,脾脏抗原特异性CD8+T细胞比例显著低于对照组。低剂量Ng（-）（pIL-12）佐剂（5μg）联合HBsAg疫苗免疫能够有效诱导体液免疫和细胞免疫,三次免疫能够快速清除HBV感染。3.5 pμg Ng（-）（μIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫能够促进具有交叉提呈功能的CD8α+/CD103+ DCs成熟。在接受pAAV/HBV 1.2质粒攻击后,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫小鼠,脾脏CD8α+ DCs的比例、绝对数明显上调,CD8α+ DCs上CD40、CD80、CD86的表达水平明显提高。CD103+DCs上也观察到了类似的现象。4.在接受ppAAV/HBV 1.2质粒攻击后,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HHsAg疫苗免疫小鼠体内巨噬细胞向M2极化受到抑制,高表达CD86,低表达M2型分子CD206。与对照组相比,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组脾脏中MDSCs的比例有一定程度的降低。这些结果表明,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂在一定程度上能降低HBV感染诱导的免疫抑制。5.5μg Ng（-）（pIL-12）佐剂有利于HBsAg疫苗诱导抗原特异性CD4+T细胞产生。与对照组相比,5μgNg（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫组可以观察到外周血高水平的抗原特异性CD4+T细胞,并高表达活性分子CD69。在pAAV/HBV 1.2质粒攻击后,与对照组相比,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组小鼠脾脏中CD4+T细胞以及抗原特异性CD11ahiCD49dhi CD4+T细胞比例及其绝对数明显增加。6.5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗诱导机体产生抗HBV特异性CD8+T细胞。与对照组相比,5μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗免疫可以明显增加外周血抗HBV特异性的CD11ahi CD8αlo T细胞比例,并促进抗原特异性CD11ahi CD8αlo终末分化为短寿命效应细胞（SLECs）。在接受pAAV/HBV 1.2质粒攻击后,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组脾脏中CD8+T细胞以及CD11ahi CD8ααl0T细胞的绝对数明显增加,并低表达免疫抑制分子LAG-3、TIGIT,处于活化状态。同时,5 μg Ng（-）（pIL-12）佐剂联合HBsAg疫苗组抗原特异性CD8+T细胞中SLECs比例明显增加,并高表达CD107a,低表达TIGIT,处于高度活化状态,有利于防止HBV再次感染。结论及研究意义:1.本研究证实,CS、y-PGA制备HBsAg Ng（+）单次免疫能够快速诱导抗HBV体液免疫和细胞免疫,可以获得长效抗HBV感染保护。2.本研究证实,CS、y-PGA制备Ng（-）（pIL-12）对HBsAg疫苗具有剂量相关性佐剂效果。5μg Ng（-）（pIL-12）佐剂有利于HBsAg疫苗诱导体液免疫和细胞免疫,快速清除HBV感染。这个过程中,APCs抗原提呈功能增强,抗原特异性CD4+T细胞和CD8+ T细胞增加,并促进抗原特异性CDllahiCD8αlo终末分化为SLECs,有利于防止HBV再次感染。3.我们的研究为预防性疫苗以及治疗性疫苗研究提供新的佐剂选择,并提供使用方法参考。
论文目录
文章来源
类型: 博士论文
作者: 王海刚
导师: 张建
关键词: 预防性疫苗,纳米凝胶,佐剂
来源: 山东大学
年度: 2019
分类: 基础科学,医药卫生科技
专业: 生物学,基础医学
单位: 山东大学
分类号: R392
总页数: 134
文件大小: 10313K
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