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重组鸭瘟病毒感染宿主生物学特性观察

2020-12-02阅读(724)

重组鸭瘟病毒感染宿主生物学特性观察

论文摘要

细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）是第二代承载DNA大片段的克隆载体系统。目前,本实验室成功地将BAC载体系统插入鸭瘟病毒中国强毒株（Duck plague virus Chinese virulent strain,DPV CHv）基因组的胸苷激酶（Thymidine kinase,TK）基因序列中,从而获得了重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G。然而,DPV CHv-BAC-G的生物学特性尚未完全明确,前期研究仅对其在体外细胞培养中的部分特性作了初步研究。本文通过禽胚和雏鸭对DPV CHv-BAC-G的生物学特性进行了较为全面的探究,并在体外细胞中分析了DPV CHv-TK的瞬时表达对DPV CHv-BAC-G增殖的影响,主要研究内容和结果如下:1、重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸡胚上的生物学特性将DPV CHv-BAC-G株细胞毒液（病毒拷贝数:107.0.0 copies/0.2mL;剂量:0.2mL/胚）经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚中,10d后,所有接种鸡胚均正常存活,说明DPV CHv-BAC-G对鸡胚不具致死性。采用荧光定量PCR方法检测了脑、肝脏及肠组织中的病毒载量,结果显示,各组织样本中的病毒拷贝数极低,在个别样本中未检出病毒基因组,表明DPV CHv-BAC-G在鸡胚中的增殖能力极弱。2、重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸭胚上的生物学特性将DPV CHv-BAC-G株细胞毒液（病毒拷贝数:107.0.0 copies/0.2mL;剂量:0.2mL/胚）经尿囊腔接种于10日龄鸭胚中,144h后,接种鸭胚死亡率为100%,表明DPV CHv-BAC-G对鸭胚具有高致死性。从剖检变化、组织显微病理学和超微结构病理学三方面观察到DPV CHv-BAC-G引起脑、肝组织及其细胞病变十分显著,且病变程度随接种时间不断加重,表明DPV CHv-BAC-G对鸭胚具有高致病性。利用透射电镜观察到DPV CHv-BAC-G病毒粒子的形态结构与DPV CHv亲本株病毒粒子基本相同,表明TK基因的功能缺陷和BAC载体的插入不影响DPV CHv病毒粒子的结构和组装。采用荧光定量PCR方法检测了DPV CHv-BAC-G在鸭胚内的动态分布规律,结果显示,DPV CHv-BAC-G在尿囊液和羊水的混合液中的增殖表现与DPV CHv亲本株无显著差异;在脑和躯干（去除头、四肢和内脏等）中,DPV CHv-BAC-G的增殖开始较早（均为36hpi）,比DPV CHv亲本株分别提前约24h和12h左右,表明DPV CHv-BAC-G在胚胎内具有比亲本病毒DPV CHv更快速的增殖特性。采用荧光定量PCR方法检测了接种鸭胚的脑、肝脏和躯干组织中一些天然免疫相关基因的转录水平,结果显示,部分模式识别受体（Pattern recognition receptor,PRR）和抗病毒因子等的转录水平均有不同程度的上调,表明病毒基因组的复制能有效诱导胚胎中天然免疫抗病毒反应的发生。3、重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在雏鸭体内的生物学特性将DPV CHv-BAC-G株细胞毒液（病毒拷贝数:107.0.0 copies/0.2mL;剂量:1.0mL/只）对1日龄雏鸭进行肌注,2周后,所有雏鸭均正常存活,表明DPV CHv-BAC-G对雏鸭不具致死性。采用常规PCR方法对1dpi、3dpi和5dpi的雏鸭进行病毒检测,结果显示,各雏鸭的血液、小肠和肝脏中均未检出DPV CHv-BAC-G,表明DPV CHv-BAC-G未能在雏鸭体内进行生长增殖。荧光定量PCR检测结果显示,1dpi和5dpi的雏鸭脑组织中部分天然免疫抗病毒因子的转录水平均未显著变化,表明DPV CHv-BAC-G在雏鸭体内的复制缺陷与天然免疫抗病毒机制无关。4、DPV CHv-TK的瞬时表达对重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G体外增殖的影响构建了pCAGGS-DPV CHv-TK真核表达载体,将其在体外鸭成纤维细胞（Duck embryo fibroblast,DEF）上进行转染以表达DPV CHv-TK,而后使用该DEF培养物进行DPV CHv-BAC-G的培养。荧光定量PCR检测结果显示,与DPV CHv-BAC-G在转染pCAGGS空载质粒的DEF培养物中的增殖表现相比,其在表达病毒TK的DEF培养物中的增殖未出现显著变化,表明DPV CHv-TK的瞬时表达对DPV CHv-BAC-G的体外增殖无显著影响,进一步验证了TK基因是DPV体外增殖的非必需基因。综上,DPV CHv-BAC-G对鸡胚不具致死性,且在鸡胚中的增殖能力极弱;DPV CHv-BAC-G对鸭胚具有高致死性和高致病性,在胚胎内具有比亲本病毒DPV CHv更快速的增殖特性,且病毒基因组的复制能有效诱导胚胎中天然免疫相关基因转录水平的显著变化;DPV CHv-BAC-G无法在雏鸭体内生长增殖;在体外细胞中,瞬时表达回补DPV CHv-TK对DPV CHv-BAC-G的增殖无显著性影响。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 部分缩写及符号说明
  • 1 文献综述
  •   1.1 疱疹病毒概述
  •   1.2 细菌人工染色体技术
  •   1.3 α疱疹病毒的TK基因
  •     1.3.1 α疱疹病毒的TK基因的特点及转录表达
  •     1.3.2 TK基因对α疱疹病毒毒力的影响
  •     1.3.3 TK基因对α疱疹病毒潜伏感染的影响
  •   1.4 疱疹病毒诱导的天然免疫应答
  • 2 研究目的与意义
  • 3 材料与方法
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 毒株、禽胚、试验动物
  •     3.1.2 载体及菌株
  •     3.1.3 PCR引物
  •     3.1.4 主要试验试剂及耗材
  •     3.1.5 常用试剂与缓冲液的配制
  •     3.1.6 主要试验仪器设备
  •     3.1.7 实验分析软件
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸡胚上的生物学特性研究
  •     3.2.2 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸭胚上的生物学特性研究
  •     3.2.3 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在雏鸭体内的生物学特性研究
  •     3.2.4 DPV CHv-TK的瞬时表达对重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G体外增殖的影响
  • 4 试验结果
  •   4.1 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸡胚上的生物学特性研究
  •     4.1.1 致死性
  •     4.1.2 DPV CHv-BAC-G在 SPF鸡胚内的增殖
  •   4.2 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸭胚上的生物学特性研究
  •     4.2.1 致死性
  •     4.2.2 致病性
  •     4.2.3 DPV CHv-BAC-G病毒粒子的形态学观察
  •     4.2.4 DPV CHv-BAC-G在鸭胚内的动态分布规律
  •     4.2.5 DPV CHv-BAC-G诱导胚胎内天然免疫相关基因转录水平的变化
  •   4.3 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在雏鸭体内的生物学特性研究
  •     4.3.1 致死性
  •     4.3.2 DPV CHv-BAC-G在雏鸭体内的增殖
  •     4.3.3 DPV CHv-BAC-G诱导雏鸭脑中天然免疫相关基因转录水平的变化
  •   4.4 DPV CHv-TK的瞬时表达对重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G体外增殖的影响
  •     4.4.1 真核表达载体pCAGGS-DPV CHv-TK的构建
  •     4.4.2 pCAGGS-DPV CHv-TK的转染表达对DPV CHv-BAC-G体外增殖的影响
  • 5 分析及讨论
  •   5.1 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸡胚上的生物学特性分析
  •   5.2 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在鸭胚上的生物学特性分析
  •   5.3 重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G在雏鸭体内的生物学特性分析
  •   5.4 DPV CHv-TK的瞬时表达对重组鸭瘟病毒DPV CHv-BAC-G体外增殖的影响
  • 6 结论
  • 创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 谢映

    导师: 汪铭书,方鹏飞

    关键词: 生物学特性,基因,天然免疫

    来源: 四川农业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 四川农业大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000552

    总页数: 62

    文件大小: 3306k

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