论文摘要
大菱鲆是我国重要的水产养殖鱼类,具有很高的经济价值和良好的市场前景,但由微生物引起的大菱鲆腐败变质也是十分严重。研究表明,荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是养殖鱼类低温贮藏过程中的特定腐败菌。而腐败菌的生长及特性的表达受其群体感应系统（Quorum Sensing,QS）的调控,其中,N-酰基-高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）是革兰氏阴性菌QS系统中最常见的一类信号分子。课题组已分离出大菱鲆源荧光假单胞菌P.fluorescens PF08和腐败希瓦氏菌S.putrefaciens SP01,其中荧光假单胞菌能产生AHLs,而腐败希瓦氏菌不产AHLs。鉴于此,本研究比较分析了不同类型外源AHLs对菌株SP01 QS信号分子表达情况的影响,进一步探讨菌株PF08对菌株SP01 AHL-QS系统及致腐性的影响,并通过接种于大菱鲆鱼块分析菌株PF08和菌株SP01的致腐能力。主要结论如下:1.生物报告菌法及气相色谱-质谱技术（Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS）检测表明了菌株SP01不产生AHLs或其活性较弱;进一步对菌株SP01 QS调控基因及腐败基因进行筛选及验证,成功扩增出luxR、csB、trxR基因的特异性引物;进而对luxR蛋白序列进行生物信息学分析,发现该蛋白无信号肽区域,不存在跨膜结构,为疏水性蛋白,具有典型的luxR家族蛋白的结构特征。2.通过外源添加AHLs前后生物被膜、运动活性等变化来研究菌株SP01对不同信号分子的利用程度。结果表明,不同类型外源AHLs信号分子对菌株生物被膜形成、群集泳动活性均有促进作用。此外,通过荧光定量PCR技术和分子对接技术探究了菌株SP01对外源信号分子的感受能力,结果表明,外源AHLs的加入均上调了菌株SP01 luxR和trxR基因的表达;其他信号分子（除C4-HSL外）的添加下调了csB基因的表达。通过分子对接结果推测,AHLs与受体蛋白luxR间结合能力越强,则越会刺激的luxR基因表达。3.通过实验室混合培养菌株PF08和菌株SP01,发现菌株PF08的添加对菌株SP01的生长、蛋白酶群集泳动活性、生物被膜的形成都具有一定的促进作用,而共培养环境中菌株SP01虽不能产生AHLs,但能感受菌株PF08无细胞上清液（Cell-free Supernatant,CFS）中AHLs,使得环境中的AHLs活性下降。利用实时荧光定量PCR技术表明菌株PF08的添加和菌体重悬液（Cell-free,CS）的添加使得菌株SP01 luxR基因的表达下调,而CFS添加组使得luxR基因表达量明显上调,为对照组的0.58倍;菌株PF08的添加抑制csB、trxR基因的表达;综上结果表明菌株PF08的添加促进了菌株SP01腐败特性的表达。4.通过微生物（菌落总数）及理化指标（TBA值、pH值、挥发性成分）等的变化,探讨了接种菌株SP01、菌株PF08及二者混合菌后对微冻和冷藏条件大菱鲆无菌鱼块的致腐能力。结果表明:在冷藏条件下,共培养菌组中菌株PF08和菌株SP01菌落数均显著高于单独接种组,且共培养菌组的菌落总数、TBA值、pH值均高于单独接菌组。与冷藏相比,微冻可以较好地延缓菌落总数、pH值、TBA的增加。进一步通过GC-MS分析表明醇类、醛酮类物质在冷藏大菱鲆鱼肉中含量较高,为主要挥发性物质。经接菌处理后,醛酮类、醇类的含量都增加,且共培养菌组致腐效果较明显,这可能是因为共培养菌株之间存在协同作用,可相互促进彼此的生长并提高腐败活性,加速无菌鱼块的腐败。
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摘要abstract第一章 绪论 1.1 细菌群体感应 1.1.1 细菌群体感应概况 1.1.2 群体感应的类型 1.2 大菱鲆简介 1.2.1 大菱鲆资源及消费现状 1.2.2 大菱鲆研究现状 1.3 大菱鲆腐败与群体感应 1.3.1 大菱鲆腐败过程中菌相变化 1.3.2 大菱鲆腐败与群体感应 1.4 细菌间的相互作用 1.4.1 概况 1.4.2 群体感应在细菌相互作用中的研究进展 1.5 研究目的意义、内容 1.5.1 研究目的意义 1.5.2 研究内容第二章 腐败希瓦氏菌群体感应相关基因luxR及腐败相关基因csB、trxR筛选及验证 2.1 前言 2.2 材料与设备 2.2.1 菌株及培养条件 2.2.2 主要试剂 2.2.3 主要设备 2.3 方法 2.3.1 菌株SP01的AHLs检测 2.3.2 基因PCR扩增及序列分析 2.3.3 菌株SP01 群体感应调控基因luxR及腐败相关基因csB、trxR的验证 2.3.4 luxR基因的分析及其编码蛋白质 2.4 结果与分析 2.4.1 检测菌株SP01中AHLs信号分子 2.4.2 菌株SP01群体感应调控基因luxR及腐败相关基因csB、trxR的验证 2.4.3 luxR蛋白序列分析 2.5 小结第三章 外源信号分子AHLs对腐败希瓦氏菌AHL-QS系统表达情况的影响. 3.1 前言 3.2 材料与设备 3.2.1 菌种与培养条件 3.2.2 材料准备 3.2.3 主要试剂及仪器 3.3 材料与方法 3.3.1 外源AHLs添加对菌株SP01生长的影响 3.3.2 外源AHLs添加对菌株SP01蛋白酶活性的影响 3.3.3 外源AHLs添加对菌株SP01运动性的影响 3.3.4 外源AHLs添加对菌株SP01生物被膜的影响 3.3.5 外源AHLs添加对菌株SP01luxR及腐败相关基因表达水平的影响 3.3.6 外源AHLs对菌株SP01 受体蛋白luxR影响 3.3.7 数据分析 3.4 结果与分析 3.4.1 外源AHLs对菌株SP01生长的影响 3.4.2 外源AHLs对菌株SP01蛋白酶及运动性的影响 3.4.3 外源AHLs对菌株SP01生物被膜的影响 3.4.4 外源AHLs对菌株SP01QS及腐败相关基因表达水平的影响 3.4.5 外源AHLs对菌株SP01luxR受体蛋白影响 3.5 小结第四章 荧光假单胞菌对腐败希瓦氏菌AHL-QS系统及致腐性的影响 4.1 前言 4.2 材料与仪器 4.2.1 菌种及培养条件 4.2.2 试剂 4.2.3 仪器 4.3 方法 4.3.1 菌株PF08无细胞上清液（CFS）及菌体重悬液（CS）的制备 4.3.2 菌株PF08CFS及CS对菌株SP01菌体密度的影响 4.3.3 菌株PF08CFS及CS对菌株SP01蛋白酶和运动活性的影响 4.3.4 菌株PF08CFS及CS对菌株SP01生物被膜形成的影响 4.3.5 菌株PF08与菌株SP01共培养对菌株SP01活菌数的影响 4.3.6 菌株PF08与菌株SP01共培养对菌株SP01蛋白酶和运动活性的影响 4.3.7 菌株PF08与菌株SP01共培养对菌株SP01生物被膜形成的影响 4.3.8 菌株PF08与菌株SP01共培养对AHLs活性的影响 4.3.9 菌株PF08对菌株SP01QS及腐败基因表达水平的影响 4.3.10 数据分析 4.4 结果与分析 4.4.1 菌株PF08CFS及CS对菌株SP01生长的影响 4.4.2 菌株PF08CFS及CS对菌株SP01蛋白酶及运动活性的影响 4.4.3 菌株PF08CFS及CS对菌株SP01生物被膜形成的影响 4.4.4 菌株PF08与菌株SP01共培养对菌株SP01的影响 4.4.5 菌株PF08对菌株SP01 luxR基因表达的影响 4.4.6 菌株PF08对菌株SP01腐败相关基因表达的影响 4.5 小结第五章 腐败希瓦氏菌及其与荧光假单胞菌共培养对微冻和冷藏大菱鲆致腐能力的影响 5.1 引言 5.2 材料和方法 5.2.1 材料 5.2.2 仪器与设备 5.3 方法 5.3.1 无菌鱼块制备 5.3.2 细菌菌悬液制备 5.3.3接种与贮藏实验 5.3.4 指标测定 5.3.5 数据分析 5.4 结果与分析 5.4.1 菌落计数 5.4.2 pH 5.4.3 TBA 5.4.4 GC-MS分析结果 5.5 小结第六章 总结、创新点和展望 6.1 总结 6.2 创新点 6.3 展望参考文献硕士期间发表论文情况致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 高娜娜
导师: 励建荣,李婷婷
关键词: 腐败希瓦氏菌,荧光假单胞菌,腐败变质,群体感应
来源: 渤海大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,轻工业手工业
单位: 渤海大学
基金: 国家自然科学基金面上项目:基于群体感应途径的荧光假单胞菌对大菱鲆的致腐机制(No.31471639),国家重点研发计划(No.2017YFD0400106)
分类号: TS201.3
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标签：腐败希瓦氏菌论文; 荧光假单胞菌论文; 腐败变质论文; 群体感应论文;
基于AHLs介导的群体感应系统对荧光假单胞菌与腐败希瓦氏菌协同致腐机制探究
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