产糖化酶菌株黑曲霉在底物和溶解氧浓度波动下的胞内代谢物浓度动态响应规律探究

论文摘要

糖化酶属于一种淀粉酶,拥有水解全部D-葡萄糖苷键的能力,工业生产的糖化酶具有热稳定性、pH稳定性、底物特异性等特性。淀粉酶的市场已发展成为工业酶的第二大市场,具有十分重要的研究价值。但在黑曲霉产糖化酶发酵过程放大中始终无法达到实验室规模的产品得率。不均匀的混合是影响工艺放大的关键因素,微生物在波动环境中的动态响应可能是导致放大困难的关键原因。因此,本文主要通过Scale-down实验模拟了大规模发酵过程中的浓度梯度（底物和溶解氧梯度）,研究了黑曲霉胞内代谢物动态响应规律和对产物得率的影响。首先采用稀释率为0.08 h-1的恒化培养,通过高、低浓度的过量葡萄糖浓缩液脉冲刺激,研究了黑曲霉胞内外代谢产物的动态响应。发现碳通量通过中心碳代谢（central carbon metabolism,CCM）的周转时间合计约250 s（其中PP途径50 s,EMP途径20 s,TCA循环189 s）,并估算出CCM中各代谢物浓度的上限。同时在本研究的黑曲霉菌株中观察到其他菌种中发现的ATP悖论。随后,通过自行设计的脉冲装置进行周期性底物脉冲,模拟了大规模生产存在的底物梯度,使微生物反复经历“盛宴/饥饿”循环,发现大部分胞内响应与单次低浓度葡萄糖脉冲响应相同。但周期性底物脉冲后,菌体的生物量有6%的降低,而糖化酶的得率有12%的升高。在胞内氨基酸的测定中发现菌体合成前体氨基酸Glu与Lys的降低和糖化酶合成前体氨基酸Ala和Leu的升高,这可能是造成菌浓降低和产量升高的原因。溶氧是影响菌体生长代谢的另外一大重要因素,设计了溶氧波动装置来对大规模生产的溶解氧梯度进行模拟,溶氧周期性限制-脉冲实验结果表明,溶氧的限制对产物和副产物的形成均有促进作用,糖化酶比生成速率提高了37%;对菌体生长也有较大影响,使得菌浓降低了72%。溶氧的限制导致EMP和PP途径中的胞内代谢物（除3PG外）呈下降趋势,其中Asp和ATP等代谢物同溶解氧有显著正相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
•   1.1 糖化酶的概述
•     1.1.1 糖化酶的结构与性质
•     1.1.2 糖化酶的研究进展
•     1.1.3 糖化酶的测定方法
•   1.2 黑曲霉的生理特性及研究发展
•   1.3 波动条件模拟实验
•     1.3.1 恒化培养实验
•     1.3.2 脉冲刺激响应实验
•   1.4 快速取样方法的介绍
•   1.5 同位素标记及质谱分析方法的应用
•   1.6 研究目的、内容及意义
•     1.6.1 研究目的
•     1.6.2 研究内容
•     1.6.3 研究意义
• 第2章 实验材料与方法
•   2.1 菌种
•   2.2 培养基
•   2.3 实验仪器
•   2.4 培养方法
•     2.4.1 菌种活化与保藏
•     2.4.2 接种
•     2.4.3 批培养
•     2.4.4 恒化培养
•   2.5 取样方法
•     2.5.1 快速取样方法
•     2.5.2 胞外物质快速取样
•     2.5.3 胞内物质快速取样
•   2.6 分析测定方法
•     2.6.1 菌体干重的测定
•     2.6.2 残糖的测定
•     2.6.3 糖化酶浓度的测定
•     2.6.4 胞外有机酸浓度的测定
•     2.6.5 胞内核苷酸、有机酸和磷酸糖类物质的测定
•     2.6.6 胞内氨基酸的测定
•     2.6.7 OUR与CER的测定
•     2.6.8 溶解氧（DO）的测定
• 13C内标物质以及胞内物质标曲的制作'>  2.7¹³C内标物质以及胞内物质标曲的制作
• 第3章 黑曲霉在高低浓度葡萄糖单次脉冲后动态响应的研究
•   3.1 引言
•   3.2 单次底物脉冲刺激实验设计
•     3.2.1 单次脉冲浓度的确定
•     3.2.2 单次脉冲时间的确定
•   3.3 恒化稳态的分析
•     3.3.1 恒化稳态的建立
•     3.3.2 恒化稳态的参数分析
•     3.3.3 不同菌种恒化稳态代谢物水平的比较
•   3.4 单次底物脉冲后胞外物质的分析
•   3.5 单次底物脉冲后胞内代谢物的响应
•     3.5.1 中心碳代谢途径
•     3.5.2 胞内氨基酸
•     3.5.3 细胞内能量类物质的响应
•   3.6 同大肠杆菌、产黄青霉、酿酒酵母脉冲实验的比较分析
•   3.7 本章小结
• 第4章 黑曲霉胞内代谢物在周期性底物脉冲中的响应情况研究
•   4.1 引言
•   4.2 周期性脉冲实验的设计
•     4.2.1 周期性脉冲浓度的确定
•     4.2.2 周期性脉冲取样时间的确定
•   4.3 周期性脉冲装置的设计与搭建
•   4.4 周期性底物脉冲及取样的操作步骤
•   4.5 周期性脉冲后宏观参数的分析
•   4.6 周期性脉冲后胞外物质的分析
•     4.6.1 胞外糖浓度的分析
•     4.6.2 胞外有机酸的分析
•   4.7 胞内核苷酸等能量物质的分析
•   4.8 胞内中心碳代谢中间代谢物的分析
•   4.9 周期性脉冲后胞内氨基酸的分析
•   4.10 本章小结
• 第5章 黑曲霉在溶氧周期性波动下的响应研究
•   5.1 引言
•   5.2 实验设计
•     5.2.1 氧限制实验的设计
•     5.2.2 氧不限制实验的设计
•     5.2.3 周期性氧限制-脉冲实验的设计
•     5.2.4 培养基组分
•   5.3 氧限制与氧不限制实验的结果对比分析
•     5.3.1 宏观数据分析
•     5.3.2 生理代谢数据分析
•   5.4 周期性溶氧限制-脉冲实验装置的搭建
•   5.5 周期性溶氧限制-脉冲实验宏观参数的分析
•   5.6 周期性溶氧限制-脉冲实验胞外物质的分析
•     5.6.1 胞外糖浓度的分析
•     5.6.2 胞外有机酸的分析
•     5.6.3 胞外糖化酶酶活的分析
•   5.7 周期性溶氧限制-脉冲实验胞内核苷酸等能量类物质的趋势分析
•   5.8 周期性溶氧限制-脉冲实验胞内中心碳代谢中间代谢物的变化趋势分析
•     5.8.1 糖酵解途径胞内代谢物的动态响应
•     5.8.2 磷酸戊糖途径胞内代谢物的动态响应
•     5.8.3 三羧酸循环胞内代谢物的动态响应
•   5.9 周期性溶氧限制-脉冲实验胞内氨基酸的趋势分析
•   5.10 本章小结
• 第6章 总结与展望
•   6.1 总结
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文情况
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王帅

导师: 夏建业,刘玉伟

关键词: 恒化培养,底物脉冲,溶氧波动,快速取样,动态响应

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q936

总页数: 91

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