lamin基因调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的研究

论文摘要

干细胞是一类自我更新和多向分化潜能两种特性的细胞群,这些特征决定了其在医学治疗和器官再生方面具有非常广阔的应用前景。生殖干细胞（Germline Stem Cells,GSC）分裂与分化命运决定方面的研究,已成为干细胞与发育生物学领域关注的热点。自摩尔根发现基因的连锁互换定律以来,果蝇（Drosophila melanogaster）一直作为遗传学和发育生物学研究领域重要的模式生物。因具有可靠的干细胞标记和清晰的发育谱系等优点,果蝇卵巢GSC常被作为生殖干细胞研究的优良模型。核纤层蛋白（Lamin）作为一类中间纤维（Intermediate filament,IF）蛋白为细胞核膜提供骨架支撑,同时还参与染色质组织、DNA复制和损伤修复等过程。我们前期的工作发现,与野生型果蝇（oregon）相比,随着时间的推移,lamin基因突变体果蝇卵巢GSC的数量有降低的趋势。为了确证上述结果,进一步探究lamin调控果蝇卵巢GSC命运的机制,我们利用免疫荧光染色、有丝分裂重组和果蝇转基因等技术,研究了lamin基因调控果蝇卵巢GSC命运的初步机制,本研究成果将贡献于干细胞分裂分化调控领域。首先,以野生型果蝇为对照,利用免疫荧光染色技术统计分析了lamin突变体果蝇卵巢GSC在羽化后不同天数的数量变化情况。果蝇卵巢顶端被称为原卵区,正常原卵区一般含有2-3个GSC。结果显示:野生型果蝇羽化后第1天（1d）和第14天（14d）正常原卵区的比例分别为97.7%和96.4%,两周内卵巢GSC数量基本无变化。lamin四组突变体(lam A25/lamA25、lamA25/lamK2、lamA25/lam04643和lamK2/lam04643)果蝇在羽化后第1d正常原卵区的比例分别为78.7%、81.8%、84.8%和88.0%;羽化后第14d分别降至27.9%、36.2%、37.6%和48.1%,表明卵巢GSC发生了显著的丢失,且lamA25/lamA25突变体果蝇卵巢GSC丢失最严重。上述结果表明lamin基因是果蝇卵巢GSC维持所必需的。其次,利用UAS/gal4系统对lamin基因分别实施内源性和外源性RNA干扰（RNA interfering,RNAi）,统计羽化后不同天数（1d、7d和14d）果蝇卵巢GSC数量变化。在内源性RNAi试验中有两个敲低组,分别为lamin基因2号和3号染色体敲低组。结果显示:对照组（未敲低亲本组）果蝇正常原卵区比例在两周内都高达92.0%以上,表明卵巢GSC数量基本没有变化。羽化后1d、7d和14d,lamin基因2号敲低组正常原卵区比例分别为84.1%、36.7%和31.2%;3号敲低组正常原卵区的比例分别为72.1%、54.8%和36.6%。两组RNAi试验结果显示:随着时间推移,内源性敲低lamin导致正常原卵区的比例明显降低,暗示其卵巢GSC数量发生了严重的下降。当外源性敲低lamin基因,实验组统计结果与对照组无明显变化（P>0.05）,表明外源性敲低lamin不影响GSC维持。另外,采用有丝分裂重组技术内源性诱导GSC克隆,分别统计1d、7d和14d标记GSC克隆的数量变化。结果显示:野生型对照组标记的GSC（基因型:FRT40A）的百分比在两周内从1d的43.7%下降到14d的42.1%,GSC数量基本无变化。而三个实验组标记的lamin突变(基因型分别为:FRT40A,lamA25、FRT40A,lamK2与FRT40A,lam04643)的GSC百分比从第1d的43.8%、45.0%和44.0%下降到第14d的15.1%、16.7%和17.3%,两周内分别有65.5%、62.9%和60.7%的GSC发生了丢失,支持lamin内源性地发挥调控GSC维持的功能。上述结果均暗示lamin基因在调控果蝇卵巢GSC维持方面发挥内源性作用。为了进一步确证lamin基因的功能,排除遗传背景的干扰,本课题构建了一系列lamin转基因载体,分别从内源和外源去挽救lamin基因缺失导致的表型。结果显示:内源性补充lamin基因能完全挽救lamin缺失的表型;仅外源性补充lamin基因无法挽救GSC的数量下降,表明lamin基因仅内源性调控果蝇卵巢GSC的维持。此外,借助免疫组织化学染色技术检测Lamin蛋白的表达模式,观察发现,Lamin蛋白在卵巢GSCs中表达量高,且定位于细胞核膜,暗示了该基因在GSC中发挥重要功能。总之,上述结果充分表明lamin基因发挥内源性调控果蝇卵巢GSC命运的功能。为了确证lamin基因表达与GSC维持的相关性,在RNA水平上,利用荧光定量PCR（qPCR）检测了lamin突变体与RNA干扰品系果蝇卵巢中lamin基因的表达。结果显示,与野生型相比,突变体和RNA干扰组中lamin表达量都有明显降低。在蛋白质水平上,利用蛋白免疫印迹（Western Blot）技术检测Lamin蛋白的表达。结果显示:lamin突变体中Lamin蛋白的表达量显著降低。此结果充分表明lamin基因表达下调是导致果蝇卵巢GSCs丢失的直接原因。再次,借助bamP-GFP报告系统研究lamin与已知BMP/Dpp-bam信号通路的关系。结果显示,对照组中GFP阴性标记的GSC数占97.7%,表明bam基因沉默是GSC维持所必需的。在lamin突变的背景下,三组实验组果蝇(bamP-GFP;lamA25/lamA25、bamP-GFP;lamA25/lamK2和bamP-GFP;lamK2/lam04643)卵巢中,分别有18.8%、30.3%和12.5%的GSC中检测到GFP标记的bam的表达,明显高于对照组2.3%比例。该结果表明lamin基因小部分地参与了GSC中bam基因的抑制（位于bam的上游）,同时暗示了lamin基因主要位于bam的下游,或通过平行于BMP/Dpp-bam信号通路来抑制GSC的分化以维持干性。既然lamin突变导致GSC数量丢失,那么缺失的GSCs是否走向凋亡?为了回答此问题,利用TUNEL技术对lamin突变果蝇的卵巢GSCs进行凋亡检测。结果显示,野生型果蝇卵巢GSC凋亡发生率为1.8%,两种lamin突变体卵巢GSC凋亡发生率分别为5.1%和5.3%,表明野生型与突变体果蝇的凋亡发生率无明显差异。此外,利用有丝分裂重组技术获得的内源性lamin突变GSC中也没有发现增加的凋亡率。该结果暗示了lamin突变的GSC提前走向分化而导致丢失。我们的工作加深了对GSC命运决定机制的理解。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 缩写及中英文对照
• 第一章 文献综述
•   1 经典模式生物—果蝇
•     1.1 果蝇简介
•     1.2 果蝇卵巢的基本结构
•   2 核纤层蛋白Lamin研究概况
•   3 调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的信号通路
•     3.1 TGF-β/Dpp信号通路
•     3.2 JAK/STAT信号通路
•     3.3 Hedgehog信号通路
•     3.4 Notch信号通路
• 第二章 实验材料与方法
•   1 实验材料
•     1.1 果蝇品系
•     1.2 主要仪器
•     1.3 实验试剂
•     1.4 引物与载体
•   2 实验方法
•     2.1 果蝇保种与饲养
•     2.2 果蝇免疫组织化学染色技术
•     2.3 果蝇卵巢基因组DNA提取
•     2.4 果蝇lamin转基因载体构建技术
•     2.5 转基因果蝇品系构建
•     2.6 FLP/FRT有丝分裂重组分析
•     2.7 果蝇卵巢总RNA提取与反转录技术
•     2.8 实时荧光定量PCR技术
•     2.9 果蝇卵巢总蛋白提取
•     2.10 蛋白免疫印迹技术
•     2.11 数据分析
• 第三章 实验结果与分析
•   3.1 果蝇不育系表型筛选
•   3.2 lamin基因调控果蝇卵巢生殖干细胞的维持
•     3.2.1 lamin基因突变导致果蝇卵巢生殖干细胞的丢失
•     3.2.2 lamin基因RNA干扰导致卵巢生殖干细胞的缺失
•     3.2.3 lamin基因内源性突变导致卵巢生殖干细胞的丢失
•   3.3 lamin转基因果蝇品系的构建
•     3.3.1 转基因载体的构建
•     3.3.2 质粒提取及转基因显微注射
•     3.3.3 转基因果蝇的鉴定
•   3.4 lamin基因缺失表型的挽救实验
•   3.5 荧光定量PCR检测卵巢lamin基因的表达
•   3.6 Lamin蛋白的表达检测
•   3.7 Lamin蛋白表达模式的检测
•   3.8 lamin与bam基因的遗传互作研究
•   3.9 lamin基因过表达分析
•   3.10 lamin突变卵巢的凋亡检测
• 第四章 讨论与展望
•   4.1 lamin基因调控果蝇卵巢生殖干细胞命运的内外源分析
•   4.2 lamin基因调控果蝇卵巢干细胞命运的机制探讨
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士期间发表论文及获奖情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 孙福玲

导师: 陈冬生

关键词: 基因,果蝇,卵巢生殖干细胞,命运,原卵区

来源: 安徽师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 安徽师范大学

分类号: Q25

总页数: 84

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