HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体的构建及其表达和纯化

论文摘要

目的:构建HIV-1ⅢB标准株、中国大陆地区主要流行株CRF-BC和海南省流行株CRF-AE野生型和突变型gp41表达载体,获得gp41重组蛋白。方法:利用基因定点突变的方法,将HIV-1ⅢB、CRF-BC和CRF-AE流行株野生型gp41基因中特定的N611Q糖基化位点天冬酰胺Asn突变为谷氨酰胺Gln,使该位点去糖基化。利用基因工程技术构建野生型pc DNA3. 1-gp41和突变型pc DNA3. 1-Mgp41表达载体。取测序正确的重组质粒转染293 T细胞,重组蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后采用免疫杂交方法进行分析。结果:测序结果显示野生型gp41的N611糖基化位点均由天冬酰胺（Asn）的编码基因（AAU）突变为谷氨酰胺（Gln）的编码基因（GAA）,成功构建了野生型和突变型gp41表达载体。琼脂糖凝胶电泳分析显示野生型和突变型HIV-1 gp41基因大小约为700 bp,Western blot免疫杂交结果显示在26 k D处出现目的条带,与预期一致。结论:成功构建了HIV-1流行株去糖基化修饰gp41突变体,为研究去糖基化修饰gp41蛋白与疾病发生发展的分子机制奠定基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 实验材料
•     1.1.2 主要仪器和设备
•   1.2 方法
•     1.2.1 野生型gp41引物设计
•     1.2.2 去糖基化gp41引物设计
•     1.2.3 野生型和去糖基化gp41表达载体的构建及鉴定
•     1.2.4 序列比对分析
•     1.2.5 野生型和去糖基化gp41重组蛋白的表达
•     1.2.6 野生型和去糖基化gp41重组蛋白的纯化转染36～48 h后收集培养上清液, 4 000 r/min低速离心5 min, 去除细胞碎片。
•     1.2.7 免疫杂交 （Westem blot） 分析
• 2 结果
•   2.1 野生型和突变型HIV-1 gp41的结构
•   2.2 野生型和突变型HIV-1 gp41基因的扩增
•   2.3 野生型和突变型重组质粒的双酶切鉴定
•   2.4 野生型和突变型DNA序列的同源比对
•   2.5 野生型和突变型重组蛋白的免疫印迹分析
•   2.6 野生型和突变型重组蛋白的浓度检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 邵继平,符健

关键词: 病毒,包膜糖蛋白,去糖基化突变体,表达和纯化

来源: 中国免疫学杂志 2019年05期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,基础医学

单位: 海南医学院海南省药物临床前药理毒理学研究重点实验室

基金: 海南省科技厅社会发展项目(ZDYF2016126)

分类号: R373

页码: 579-583

总页数: 5

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