禾谷镰刀菌硫氧还蛋白还原酶TRR基因功能研究

论文摘要

小麦赤霉病因严重威胁小麦的产量品质,阻碍小麦生产的稳步发展,受到世界的广泛关注。禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）是引起小麦赤霉病的重要病原之一,其产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol,DON）严重威胁人畜的健康。许多酶或者非酶的机制可以有效清除活性氧,其中较为重要的机制是包含硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TRR）的硫氧还蛋白系统。硫氧还蛋白系统具有强烈的抗氧化和清除自由基的作用。目前已知,硫氧还蛋白还原酶在氧化型和还原型硫氧还蛋白的循环中起着关键作用,但其在植物病原真菌中的具体机制尚不清楚。在禾谷镰刀菌基因组中有一个硫氧还蛋白还原酶基因,命名为FgTRR。构建定位菌株发现FgTRR定位于细胞质中。通过与稻瘟病菌、酿酒酵母和烟曲霉的TRR基因进行序列比对发现,FgTRR具有FAD-binding domainⅠ（GXGXX,X为任意氨基酸）、FAD-binding domainⅡ（GXFAXGDV）和NADPH-binding domain（GGGXXA）等硫氧还蛋白还原酶家族典型的结构域;通过进化树比对发现FgTRR的亲缘关系同物种进化趋势基本一致。利用split-marker PCR的方法对TRR基因进行敲除,通过PCR水平和Southern blot水平的验证得到7个?TRR突变体。对?TRR突变体的生物学表型研究发现:与野生型菌株相比,?TRR突变体的菌丝生长速度明显减慢,对分生孢子的形态没有影响,但表现出产孢量下降和萌发延迟的现象,表明FgTRR在菌丝生长和分生孢子萌发中存在缺陷;与野生型菌株产生正常的子囊壳以及子囊不同,?TRR突变体产生的子囊壳形态较小且不能产生子囊和子囊孢子,进一步对有性生殖进行研究发现,?TRR突变体表现出雌性不育的现象,这些结果表明FgTRR虽不是有性生殖所必须,但严重影响有性生殖过程;?TRR突变体在0.7 M KCl、0.7 M NaCl、1 M山梨醇和0.2 g/L刚果红中表现出抗性减弱,在0.05%SDS中表现出抗性增强,表明FgTRR参与禾谷镰刀菌的盐胁迫、细胞壁和细胞膜的完整性;?TRR突变体在5 mM H2O2和15μM甲萘醌中表现出敏感性增强,抗性减弱的现象,表明FgTRR影响氧胁迫过程;?TRR突变体在色素积累方面存在缺陷,色素生物合成相关基因的表达水平显著降低;与野生型相比,?TRR突变体致病性下降94%,侵染小麦和玉米须的能力减弱,DON毒素的产量显著下降,DON毒素生物合成相关基因的表达量下降显著,表明FgTRR在致病性方面至关重要;用5 mM H2O2处理1 h后,野生型菌株和?TRR突变体的原生质体均表现出质膜的磷脂酰丝氨酸外翻,发生外翻的原生质体的比例分别为18%和33%,而在未经H2O2处理的?TRR突变体中V-FITC阳性原生质体的数量同样多于野生型菌株,对菌丝细胞内活性氧进行检测发现?TRR突变体中活性氧积累多于野生型菌株,上述结果表明FgTRR参与细胞凋亡过程。综上所述,本研究证明FgTRR在生长发育、有性生殖、色素合成、致病性和细胞凋亡等方面发挥重要的作用。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
•   1.1 禾谷镰刀菌概述
•     1.1.1 小麦赤霉病
•       1.1.1.1 小麦赤霉病症状及病害循环
•       1.1.1.2 小麦赤霉病病害防治
•     1.1.2 禾谷镰刀菌
•       1.1.2.1 生物学特征
•       1.1.2.2 次级代谢产物—DON毒素
•       1.1.2.3 禾谷镰刀菌基因功能的研究进展
•   1.2 硫氧还蛋白还原酶
•     1.2.1 硫氧还蛋白系统研究进展
•     1.2.2 硫氧还蛋白还原酶
•       1.2.2.1 硫氧还蛋白还原酶的结构
•       1.2.2.2 硫氧还蛋白还原酶作用机制及功能
•       1.2.2.3 硫氧还蛋白还原酶最新研究进展
•   1.3 研究目的和意义
• 2 材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 供试载体与菌株
•     2.1.2 工具酶和主要试剂
•     2.1.3 主要软件和数据库
•       2.1.3.1 主要软件工具
•       2.1.3.2 主要网站及数据库
•     2.1.4 主要培养基配方及主要试剂配方
•       2.1.4.1 主要培养基配方
•       2.1.4.2 主要试剂配方
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 禾谷镰刀菌硫氧还蛋白还原酶（TRR）的生物信息学分析
•     2.2.2 禾谷镰刀菌PH-1菌株的保存
•     2.2.3 禾谷镰刀菌基因组DNA、RNA提取和cDNA获得
•       2.2.3.1 CTAB法提取DNA
•       2.2.3.2 Trizol法提取RNA
•       2.2.3.3 cDNA链合成
•       2.2.3.4 荧光定量PCR
•     2.2.4 禾谷镰刀菌FgTRR基因敲除片段的构造和连接过程
•       2.2.4.1 目的基因的扩增
•       2.2.4.2 Split-marker PCR敲除体系构建
•     2.2.5 原生质体制备和转化
•     2.2.6 PCR验证敲除转化子
•     2.2.7 Southern blot验证敲除转化子
•     2.2.8 禾谷镰刀菌FgTRR回复和定位菌株构造和验证
•       2.2.8.1 FgTRR回复载体的构建
•       2.2.8.2 FgTRR-C回复菌株的获得
•       2.2.8.3 FgTRR-GFP定位菌株的获得
•     2.2.9 禾谷镰刀菌FgTRR基因敲除突变体表型分析
•       2.2.9.1 菌丝生长发育状况观察
•       2.2.9.2 无性生殖阶段的测定与观察
•       2.2.9.3 分生孢子萌发状况观察
•       2.2.9.4 有性生殖表型观察
•       2.2.9.5 致病性测定
•       2.2.9.6 DON毒素产量测定
•       2.2.9.7 胁迫试验
•       2.2.9.8 色素相关基因定量分析
•       2.2.9.9 细胞磷脂酰丝氨酸外翻
•   2.3 PCR引物
• 3 结果与分析
•   3.1 FgTRR结构域和进化树分析
•   3.2 FgTRR-GFP的亚细胞定位
•   3.3 FgTRR敲除突变体的获得
•   3.4 FgTRR突变体回复验证
•   3.5 FgTRR影响菌丝的生长、分生孢子产生和萌发
•   3.6 FgTRR调控子囊壳的产生
•   3.7 FgTRR突变体降低了致病性
•   3.8 FgTRR突变体降低了色素的生物合成
•   3.9 FgTRR调控胁迫反应
•   3.10 FgTRR调控氧胁迫反应
•   3.11 FgTRR参与细胞凋亡过程
• 4 讨论
• 5 总结与展望
•   5.1 全文总结
•   5.2 后续实验展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间论文发表及获奖情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 范新悦

导师: 梁元存

关键词: 禾谷镰刀菌,硫氧还蛋白还原酶,生长发育,致病性,细胞凋亡

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 山东农业大学

分类号: S432.44

总页数: 67

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