二穗短柄草遗传转化体系的优化及着丝粒区域基因的编辑

论文摘要

着丝粒是真核生物中特殊的染色体结构区域,能够组装动粒蛋白以确保染色体的正确运动和分离。着丝粒曾被认为是在细胞分裂过程中与遗传无关的结构。然而,近来研究表明着丝粒不仅参与植物染色体的配对、分离以及维持染色体结构的稳定,同时在植物着丝粒区域存在具有转录活性的基因。而二穗短柄草Bd21作为禾本科单子叶模式植物,其基因组测序工作已经完成,组织培养及遗传转化工作的研究也较为成熟。因此本课题选取Bd21为研究材料,在本实验室建立并优化Bd21的遗传转化体系,并对植物着丝粒区域基因的功能进行研究。结合ChIP-Seq数据和RNA-Seq数据,应用生物信息分析获得具有转录活性的Bd21着丝粒单拷贝基因,根据CDS序列设计合理的靶序列并构建CRISPR-Cas9载体。通过Bd21成熟种子构建并优化其遗传转化体系,结合CRISPR-Cas9技术对Bd21着丝粒区域具有转录活性的基因进行编辑。本课题的主要研究结果如下:（1）以Bd21种子为外植体,对比不同激素、种子处理方式对Bd21愈伤组织的诱导及再生的影响。结果表明2,4-D结合剪切处理的Bd21种子诱导愈伤组织效果最佳。FPX对于愈伤组织的再生效果优于KT。光合自养生根的成活率与生根组培苗的成活率在不分伯仲的同时缩短了组培周期。（2）在农杆菌介导的Bd21的遗传转化体系优化过程中,通过设置菌液浓度、侵染时间、共培培养基pH值、集菌处理以及愈伤组织周龄等梯度对比试验探究遗传转化最优条件。结果表明:用OD600为0.6的农杆菌、侵染610周的愈伤组织15 min、在含有AS且pH为5.8的共培培养基上培养2 d的侵染效率最高达94.5%。阳性苗的转化效率为52.6%。（3）通过剪切种子、GA3和ABA激素以及用贮存时间不同的种子诱导Bd21愈伤组织,其出愈时间表明Bd21具有生理后熟特性。Bd21种子完成生理后熟所需的贮存时间与小麦种子所需的时间相近,实验结果进一步验证了Bd21与小麦在生物进化分枝上具有较近的亲缘关系。（4）结合ChIP-Seq数据和RNA-Seq数据分析筛选出具有转录活性的着丝粒基因,并通过应用qRT-PCR技术对所选基因进行试验验证。结果表明着丝粒区域与常染色质一样,确实存在具有转录活性的基因,并且在不同组织结构特异性表达。（5）本课题共获得70株抗性筛选转化苗,其中1株Bd6g06147;8株Bd2g29350;35株Bd1g40980;7株Bd1g41115。19株pCambia1391转化苗。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
•   1.1 二穗短柄草的研究进展
•     1.1.1 短柄草属的生物学特性及分布范围
•     1.1.2 温带禾本科单子叶模式植物—短柄草
•   1.2 农杆菌介导的遗传转化的研究进展
•     1.2.1 影响农杆菌介导的遗传转化的因素
•     1.2.2 二穗短柄草遗传转化的研究进展
•   1.3 CRISPR-Cas9 技术
•     1.3.1 CRISPR-Cas9 技术的研究进展
•     1.3.2 CRISPR-Cas9 的作用机制
•   1.4 CRISPR-Cas9 技术在植物中的应用
•     1.4.1 改良谷类作物的产量和相关性状
•     1.4.2 提高植物的防御反应
•     1.4.3 提高植物的非生物胁迫耐受性
•     1.4.4 研究植物功能基因组学的有效工具
•   1.5 着丝粒基因的功能研究进展
•     1.5.1 着丝粒DNA序列的组成
•     1.5.2 着丝粒的表观遗传修饰
•   1.6 本研究的主要内容
•   1.7 本研究的目的和意义
• 2 二穗短柄草遗传转化体系的优化
•   2.1 材料与试剂
•     2.1.1 实验仪器与试剂
•     2.1.2 培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 Bd21 愈伤组织的诱导
•     2.2.2 农杆菌介导的Bd21 遗传转化
•     2.2.3 农杆菌的活化
•     2.2.4 农杆菌的侵染过程
•     2.2.5 GUS染色及鉴定
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 二穗短柄草成熟胚再生体系的优化
•     2.3.2 农杆菌介导的Bd21 遗传转化体系的优化
•     2.3.3 T1 代植株的获得和PCR鉴定
•   2.4 讨论
•     2.4.1 二穗短柄草Bd21 种子愈伤组织的诱导
•     2.4.2 Bd21 愈伤组织的再生培养
•     2.4.3 Bd21 遗传转化体系的优化
• 3 Bd21 着丝粒区域基因的编辑
•   3.1 材料与试剂
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 植物叶片、种子RNA的提取
•     3.2.2 RNA反转录获得c DNA
•     3.2.3 半定量及qRT-PCR
•     3.2.4 构建CRISPR载体
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 Bd21 着丝粒区域基因的表达鉴定及其功能预测
•     3.3.2 CRISPR载体的构建
•     3.3.3 T1 代基因编辑植株的获得
•   3.4 讨论
•     3.4.1 Bd21 着丝粒区域具有转录活性的基因
•     3.4.2 二穗短柄草Bd21 着丝粒区域基因的编辑
• 4 总结与展望
•   4.1 总结
•   4.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 苗丽

导师: 王凯

关键词: 二穗短柄草,着丝粒功能基因,组织培养,遗传转化

来源: 福建农林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 福建农林大学

分类号: Q943.2

总页数: 80

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