利用CRISPRCas9技术构建TGFBI敲除的Met-5A稳定细胞株

论文摘要

目的利用CRISPRCas9基因编辑技术构建TGFBI敲除的Met-5A稳定细胞株,为进一步深入研究TGFBI低表达在人膜间皮细胞恶性转化过程中的功能角色提供技术支持。方法根据CRISPRCas9靶点设计原则针对TGFBI基因第4号外显子设计2对sgRNA（小向导RNA）,退火形成双链,连接至Bsmbl酶切后的载体质粒lentiCRISPRv2（命名为lentiCRISPRv2-T1和lentiCRISPRv2-T2）,经感受态细胞扩增后提取质粒并测序验证。提取和纯化正确插入目的片段的重组质粒,经慢病毒包装并转染Met-5A细胞,嘌呤霉素筛选阳性克隆。提取细胞及上清液总mRNA和蛋白,使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫印迹实验（Western blot）检测慢病毒系统转染后TGFBI mRNA和蛋白表达水平的变化。结果经基因测序后证实lentiCRISPRv2-T1、lentiCRISPRv2-T2重组载体质粒均正确插入了sgRNA序列;慢病毒系统转染Met-5A细胞后,v2-T1、v2-T2组TGFBI mRNA相对表达水平相比对照组明显降低（P<0.05）,且v2-T2组TGFBI mRNA相对表达水平低于v2-T1组（P<0.05）;v2-T1组TGFBI蛋白表达量下降为对照组的0.03倍,在v2-T2细胞中几乎检测不到TGFBI蛋白。结论构建了针对TGFBI第4号外显子的两组sgRNA-lentiCRISPRv2敲除载体;成功获得了TGFBI敲除的Met-5A稳定细胞株,为进一步研究TGFBI低表达在恶性胸膜间皮瘤发生发展过程中的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•   1.2 方法
•     1.2.1 sgRNA靶位点的选择及寡核苷酸链的合成
•     1.2.2 TGFBI-sgRNA载体的构建
•     1.2.3 转染感受态细胞并扩增
•     1.2.4 慢病毒包装
•     1.2.5 慢病毒转染Met-5A细胞
•     1.2.6 实时荧光定量RT-qPCR检测TGFBI基因相对表达水平
•     1.2.7 Wstern blot技术检测TGFBI蛋白相对表达水平
• 2 结 果
•   2.1 重组载体质粒的测序结果
•   2.2 嘌呤霉素筛选时Met-5A细胞形态及数量变化
•   2.3 慢病毒转染后Met-5A细胞TGFBI mRNA表达水平改变
•   2.4 慢病毒转染后Met-5A细胞TGFBI蛋白表达水平改变
• 3 讨 论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 杨杰,郑晋南,兰亚佳,张勤

关键词: 细胞,恶性胸膜间皮瘤

来源: 现代预防医学 2019年15期

年度: 2019

分类: 医药卫生科技,基础科学

专业: 生物学,肿瘤学

单位: 四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院

基金: 四川省卫生和计划生育委员会科研课题2016年普及应用项目(编号:16PJ261)

分类号: Q78;R73-3

页码: 2837-2841

总页数: 5

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