一种多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途论文和设计-陈小芬

全文摘要

本发明公开了一种多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，所述多肽为TREM2受体蛋白的胞外段41‑81位氨基酸，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。所述多肽具有促进小胶质介导的炎症反应，抑制小胶质细胞的凋亡，增强小胶质细胞的迁移能力，促进小胶质细胞对Aβ的内吞及降解，增加大脑内小胶质细胞的密度，降低大脑内Aβ淀粉样斑沉积的用途。

主设计要求

1.一种氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途；所述多肽为TREM2受体蛋白的胞外段41-81位氨基酸，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；所述多肽具有用于增加小胶质细胞促炎反应、抑制小胶质细胞凋亡、增加小胶质细胞迁移、增加小胶质细胞对Aβ内吞、增加小胶质细胞对Aβ降解、增加大脑中小胶质细胞密度、降低大脑中Aβ淀粉样斑数目的功能。

设计方案

1.一种氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途；所述多肽为TREM2受体蛋白的胞外段41-81位氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述多肽具有用于增加小胶质细胞促炎反应、抑制小胶质细胞凋亡、增加小胶质细胞迁移、增加小胶质细胞对Aβ内吞、增加小胶质细胞对Aβ降解、增加大脑中小胶质细胞密度、降低大脑中Aβ淀粉样斑数目的功能。

2.表达权利要求1所述多肽的重组载体用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

设计说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种以渐进性认知功能丧失为主要特征的神经退行性疾病，是最为常见的老年痴呆类型。AD是继心血管病、脑血管病和癌症后，老年健康的“第四杀手”。随着全球人口老龄化，AD正在成为二十一世纪最大的疾病之一。然而，尽管已付出巨大的科学努力，截至目前美国FDA和欧盟EMA只批准5种AD药物，所有这些药物都只是对症治疗，没有一种能够阻止或者延缓AD病情的进展。因此，寻找新的AD药物靶点并研制靶向药物有着极其重要的经济和社会意义。

AD患者早期出现记忆丧失、意识错乱、注意力差、失语、失用、缺乏方向感等症状，逐渐丧失思考及判断能力，难以与人沟通，生活无法自理。最终因神经细胞大量死亡影响到大部分脑区时，身体各组织器官受损，病人出现死亡。对AD病人尸检发现其大脑中具有两个主要的病理学特征：神经元内神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)及神经细胞外淀粉样斑(Amyloid plaques)沉积。淀粉样斑主要由β-淀粉样肽(Amyloid-β，通常缩写为Aβ)聚集而成，Aβ沉积引起大脑中神经突触的退化和神经元凋亡，最终引发认知功能损伤及痴呆。因而，抑制Aβ产生或促进Aβ降解对于AD的防治具有重要的意义。除了上述两种主要病理特征外，AD病人大脑内还有其他的病理特征：包括神经炎症过度激活、神经元丢失、神经突触丧失等。

2型髓系细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)属于Ig(Immunoglobulin,Ig)超家族，其编码基因位于染色体6p21上，编码的核苷酸和氨基酸序列在Genbank中的编号为NM_018965.3。TREM2是近年来新发现的AD风险基因，其编码区突变R47H可使晚发型AD的发病风险增加3倍左右，与AD的头号风险因子——APOE4的风险性相当。TREM2主要表达于大脑中的小胶质细胞上，而小胶质细胞是极其重要的先天性免疫相关细胞，为中枢神经系统提供着第一层也是最主要的一层防线，抵御外来感染，维持大脑稳态。在AD中，小胶质细胞参与并调节神经炎症反应，实时监控周围环境，迁移并聚集到病灶部位，清除中枢神经系统中的Aβ沉积和受损的神经元，从而改善AD症状，延缓进程。越来越多的证据支持TREM2介导的小胶质细胞功能维持在AD中起着十分重要的保护作用，因而TREM2成为AD药物研发的新热门靶标。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有防治阿尔茨海默病的多肽。

为实现上述目的，本发明提供一种氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

进一步，所述多肽为TREM2受体蛋白的胞外段41-81位氨基酸，其核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

进一步，所述多肽具有增加小胶质细胞促炎反应的用途。

进一步，所述多肽具有抑制小胶质细胞凋亡的用途。

进一步，所述多肽具有增加小胶质细胞迁移的用途。

进一步，所述多肽具有增加小胶质细胞对Aβ内吞的用途。

进一步，所述多肽具有增加小胶质细胞对Aβ降解的用途。

进一步，所述多肽具有增加大脑中小胶质细胞密度的用途。

进一步，所述多肽具有降低大脑中Aβ淀粉样斑数目的用途。

另一方面，本发明还提供这一种所述多肽的重组载体用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途。

TREM2 41-81的氨基酸序列为：

MKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGS SEQ ID NO：1；

TREM2 41-81对应的核苷酸序列为：

ATGAAGCACTGGGGGAGGCGCAAGGCCTGGTGCCGCCAGCTGGGAGAGAAGGGCCCATGCCAGCGTGTGGTCAGCACGCACAACTTGTGGCTGCTGTCCTTCCTGAGGAGGTGGAATGGGAGC SEQ ID NO：2。

由实施例可得，TREM2 41-81多肽能够显著改善小胶质细胞的多种功能，具体体现在：促进炎症反应，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移，并增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞和降解。通过脑立体定位注射sTREM2 41-81多肽到APP\/PS1小鼠大脑中，能够显著增加海马区域小胶质细胞的密度，并显著降低海马区域的淀粉样斑沉积。

附图说明

图1是pFUSE-hIgG1-Fc1载体的酶切图谱；

图2是sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白的SDS-PAGE银染电泳图；

图3是sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白促进小胶质细胞炎症反应的结果图；

图4是sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白抑制小胶质细胞凋亡的结果图；

图5是sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白促进小胶质细胞迁移的结果图；

图6是sTREM2 41-81-Fc融合蛋白增加小胶质细胞对Aβ42的内吞图；

图7是sTREM2 41-81-Fc融合蛋白增加小胶质细胞对Aβ42的降解图；

图8是sTREM2 41-81-Fc融合蛋白增加海马区域小胶质细胞密度的结果图；

图9是sTREM2 41-81-Fc融合蛋白降低海马区域Aβ淀粉样斑沉积的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白的制备

pFUSE-sTREM2 1-171-hIgG1-Fc1表达质粒构建：选用pFUSE-hIgG1-Fc1(购买自Invivogen，货号为pfuse-hg1fc1，载体图片见图1)为真核表达载体，克隆位点选用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，构建pFUSE-sTREM2 1-171-hIgG1-Fc1表达质粒。步骤如下：设计上游引物：5’-CG GAATTC<\/u>ATGGAGCCTCTCCGGCTGC-3’SEQ ID NO：3，其中下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游引物：5’-CCG CTCGAG<\/u>TTTGGGAAGGGGATTTCTC-3’SEQ ID NO：4，其中下划线为XhoⅠ酶切位点。

TREM2的核苷酸序列为(购买自北京义翘神州生物技术有限公司，货号HG11084-M：TREM-2 cDNA ORF Clone in Cloning Vector,Human)：

其中单下划线为蛋白的信号肽序列，波浪下划线为sTREM2 41-81氨基酸，双下划线为蛋白的跨膜(TM)和胞内段对应的核苷酸序列。

以cDNA(SEQ ID NO：5)为模板，可人工合成，SEQ ID NO：3为上游引物，SEQ ID NO：4为下游引物，PCR克隆sTREM2 1-171表达基因，胶回收纯化目的产物。再利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切pFUSE-hIgG1-Fc1质粒，胶回收大片段，用相同的酶对PCR产物进行酶切并胶回收纯化酶切产物，利用T4DNA连接酶连接sTREM2 1-171酶切产物和pFUSE-hIgG1-Fc1酶切产物，获得重组质粒pFUSE-sTREM2 1-171-hIgG1-Fc1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并培养在含有Zeocin抗性的培养基中，挑选阳性克隆，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认编码框正确，得到正确的重组质粒命名为pFUSE-sTREM21-171-hIgG1-Fc1。

pFUSE-sTREM2 41-81-hIgG1-Fc1表达质粒构建：选用pFUSE-hIgG1-Fc1为真核表达载体，克隆位点选用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，构建pFUSE-sTREM2 41-81-hIgG1-Fc1表达质粒。步骤如下：设计上游引物：5'- CAGAGCTGTCCGGAGCC<\/u>ATGAAGCACTGGGGGAGGCG-3’SEQ IDNO：6，其中下划线为部分信号肽序列；下游引物：5’-CCG CTCGAG<\/u>TTGCTCCCATTCCACCTCCTCAGSEQ ID NO：7，其中下划线为XhoⅠ酶切位点；人工合成信号肽正义序列：5'-ATGGAGCCTCTCCGGCTGCTCATCTTACTCTTTGTCACAGAGCTGTCCGGAGCC-3’SEQ ID NO：8，人工合成信号肽反义序列5'-GGCTCCGGACAGCTCTGTGACAAAGAGTAAGATGAGCAGCCGGAGAGGCTCCAT-3’SEQ ID NO：9。

以cDNA(SEQ ID NO：5)为模板，可人工合成，SEQ ID NO：6为上游引物，SEQ ID NO：7为下游引物PCR克隆包含部分信号肽序列的sTREM2 41-81表达基因，胶回收纯化目的产物。将人工合成的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9等量混合，在95℃条件下反应5min，缓慢降至室温获得复性的信号肽完整序列双链。以纯化的包含部分信号肽序列的sTREM2 41-81表达基因和复性的信号肽完整序列双链为模板，SEQ ID NO：3为上游引物，SEQ ID NO：7为下游引物PCR克隆包含信号肽序列的sTREM2 41-81表达基因，胶回收纯化目的产物。再利用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切pFUSE-hIgG1-Fc1质粒，胶回收大片段，用相同的酶对PCR产物进行酶切并胶回收纯化酶切产物，利用T4DNA连接酶连接sTREM2 41-81酶切产物和pFUSE-hIgG1-Fc1酶切产物，获得重组质粒pFUSE-sTREM2 41-81-hIgG1-Fc1，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并培养在含有Zeocin抗性的培养基中，挑选阳性克隆，并送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确认编码框正确，得到正确的重组质粒命名为pFUSE-sTREM241-81-hIgG1-Fc1。

sTREM2 1-171-Fc和sTREM2 41-81-Fc融合蛋白的表达及纯化：将鉴定正确的重组质粒进行纯化，利用TurboFect转染试剂将此质粒转染到HEK 293T细胞系中。24小时后，将培养基更换成无血清的DMEM继续培养24小时，收集培养基并通过0.45μm滤膜去除细胞碎片，将培养基与Protein A-珠子4℃孵育过夜，4℃中1000g离心5分钟，取沉淀利用PBS洗涤Protein A-珠子三次。再加入IgG Elution Buffer(购买自Thermo Fisher)振荡10秒后，10000g离心30秒，迅速将上清加入含有1M pH8.0Tris-HCl溶液(1\/10体积的IgG ElutionBuffer)的离心管中进行中和，混匀后取2μL滴于pH试纸进行验证。将蛋白溶液置于10kDa的透析膜内并在4℃PBS溶液中进行透析。利用10kDa的蛋白浓缩管(Millipore,UFC801024)离心浓缩蛋白，所得的sTREM2蛋白经SDS-PAGE电泳，测定蛋白浓度，随后进行银染鉴定其纯度。鉴定结果如图2所示，融合蛋白条带清晰，纯度较高。

实施例2：sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白对小胶质细胞炎症反应的影响

以5×10^{5<\/sup>细胞数将原代小胶质细胞(从出生后3-4天的C57BL\/6N新生小鼠大脑分离获得)铺于12孔板进行培养。24小时后，分别用20nM的sTREM2 41-81-Fc融合蛋白、sTREM21-171-Fc融合蛋白(即实施例1所得的蛋白)和Fc对照蛋白(即pFUSE-hIgG1-Fc1载体)处理细胞并在无血清培养基中继续培养4小时。立即将细胞置于冰上并用预冷1×PBS洗3次，利用TRIzol试剂(Thermo Fisher，货号15596018)提取总RNA，并使用逆转录试剂盒(北京全式金，货号AT314-02)反转录成cDNA。通过实时定量PCR技术(RT-qPCR)检测IL-6、TNF-α、IL-1β以及β-Actin的mRNA水平，以β-Actin的mRNA水平为内参分析其他三种炎症因子的水平。结果如图3所示，sTREM2 41-81-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞内IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平分别为Fc处理对照组的198.1、13.7和8.5倍；而sTREM2 1-171-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞内IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平分别为Fc处理对照组的35.8、5.8和4.1倍。上述结果说明，sTREM2 41-81-Fc融合蛋白能够显著增加小胶质细胞的炎症反应，并且其促炎功能强于sTREM2 1-171-Fc融合蛋白。}

实施例3sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白对小胶质细胞凋亡的影响

以10^{5<\/sup>细胞数将原代小胶质细胞铺于24孔板中的玻片(提前用Poly-Lysine进行包被24小时)上进行培养。48小时后，分别用20nM的sTREM2 41-80-Fc融合蛋白、sTREM2 1-171-Fc融合蛋白(即实施例1所得蛋白)和Fc对照蛋白(即pFUSE-hIgG1-Fc1载体)处理细胞并在无血清培养基中继续培养24小时。将细胞置于冰上并用预冷1×PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定20min后，用0.2％Triton X-100透膜5min。随后利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP方法进行切口末端标记(TUNEL)检测试剂盒(Promega，G3250)测定凋亡细胞，并用核染料DAPI进行核染以分析总的细胞数目。荧光显微镜拍照并统计TUNEL阳性细胞数目以及DAPI阳性细胞数目，通过比较两者的比例以定量分析各蛋白对小胶质细胞凋亡的影响。结果如图4所示，Fc处理对照组中小胶质细胞的凋亡比例为8.2％；而sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白分别处理后，小胶质细胞的凋亡比例分别下降至2.9％和2.3％，说明sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白均能够显著抑制小胶质细胞的凋亡。}

实施例4 sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白对小胶质细胞迁移的影响

以10^{5<\/sup>细胞数将原代小胶质细胞铺于Transwell小室(8μm，Costar，货号3422)上并在无血清培养基(100μL)中培养1小时。随后在小室下层分别加入600μL含有100nM sTREM241-80-Fc融合蛋白、sTREM2 1-171-Fc融合蛋白(即实施例1所得的蛋白)和Fc对照蛋白(即pFUSE-hIgG1-Fc1载体)的无血清培养基，继续培养24小时后，将细胞置于冰上吸去培养基，并用预冷1×PBS洗3次，4％多聚甲醛室温固定20min后，利用HE染色试剂盒(北京索莱宝，货号G1120)进行染色。用棉签轻轻刮去小室上层细胞以检测迁移至下层膜的细胞数目。为了排除蛋白对总细胞数的影响，统计小室上层和下层的总细胞数目(上层小室细胞未使用棉签刮拭)，然后统计分析下层迁移细胞与总细胞数目的比例。结果如图5所示，sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞的迁移率分别为Fc处理对照组的2.6和2.8倍，说明sTREM2 41-81-Fc和sTREM2 1-171-Fc融合蛋白能够显著增强小胶质细胞的迁移能力。}

实施例5 sTREM2 41-81-Fc融合蛋白对小胶质细胞内吞和降解Aβ42的影响

用20nM的sTREM2 41-81-Fc融合蛋白(即实施例1所得的蛋白)和Fc对照蛋白(即pFUSE-hIgG1-Fc1载体)处理原代小胶质细胞，12小时后加入带FAM荧光标签的寡聚体形式的Aβ42继续培养3小时后，收集细胞进行流式细胞仪检测胞内的荧光强度。结果如图6所示，sTREM2 41-81-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞对带FAM荧光标签的寡聚体形式的Aβ42的内吞水平为Fc对照组的1.6倍，说明sTREM2 41-81-Fc融合蛋白能够显著增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞。

用20nM的sTREM2 41-81-Fc融合蛋白(即实施例1所得的蛋白)或Fc对照蛋白(即pFUSE-hIgG1-Fc1载体)处理原代小胶质细胞，培养12小时后，使用溶酶体抑制剂处理30分钟，再加入寡聚体形式的Aβ42继续培养3小时，收集细胞并裂解，利用Aβ42ELISA方法检测经过处理的小胶质细胞胞内Aβ42的水平。Aβ42降解的量是由溶酶体抑制剂处理组减去没有抑制剂组的水平得到。结果如图7所示，sTREM2 41-81-Fc融合蛋白处理后，小胶质细胞内Aβ42的降解水平为Fc对照组的1.6倍，说明sTREM2 41-81-Fc融合蛋白蛋白能够显著增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的降解。

实施例6 sTREM2 41-81-Fc融合蛋白对APP\/PS1小鼠大脑内小胶质细胞密度和Aβ淀粉样斑沉积的影响

取7只9个月大的APP\/PS1小鼠(4雄3雌)，异氟烷麻醉后置于脑立体定位仪上，小心剪开头皮找到前囟位置，以前囟为原点找到位置(海马区域：±2.0mm，-2.2mm)，并在此位置打孔。利用微量注射器以0.2μL\/min速度、深度2.0mm注射蛋白。左右半脑分别注射Fc对照蛋白(即pFUSE-hIgG1-Fc1载体)或sTREM2 41-81-Fc融合蛋白(即实施例1所得的蛋白)，蛋白浓度为2μg\/μL，各注射3μL。注射完成后让针头停留5min使蛋白充分扩散，缓慢抽出注射器，缝合伤口并涂上红霉素，将小鼠放回饲养笼饲养。注射7天后，收取脑组织，利用小胶质细胞特异性抗体Iba1(1:200,Wako，019-19741)进行免疫荧光染色，结果如图8所示，注射Fc对照蛋白的区域中小胶质细胞面积为1.1％，注射sTREM2 41-81-Fc融合蛋白的区域中小胶质细胞面积为3.1％。上述结果说明，sTREM2 41-81-Fc融合蛋白注射到海马区域后，能够显著增加小胶质细胞的密度。同时利用Aβ抗体(1:400，MOAB2，Abcam，ab126649)进行淀粉样斑免疫荧光染色，统计分析Aβ淀粉样斑的分布。结果如图9所示，注射Fc对照蛋白的区域Aβ淀粉样斑沉积1.9％，注射sTREM2 41-81-Fc融合蛋白的区域Aβ淀粉样斑沉积1.5％。以上结果表明sTREM2 41-81-Fc融合蛋白注射到海马区域后，能够显著降低该区域的Aβ淀粉样斑沉积。

综上所述，TREM2 41-81多肽能够显著改善小胶质细胞的多种功能，具体体现在：促进炎症反应，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移，并增加小胶质细胞对寡聚体Aβ42的内吞和降解。通过脑立体定位注射sTREM2 41-81多肽到APP\/PS1小鼠大脑中，能够显著增加海马区域小胶质细胞的密度，并显著降低海马区域的淀粉样斑沉积。因而，TREM2 41-81多肽或表达该蛋白的mRNA脂质体、DNA质粒载体或者携带其编码基因的病毒载体在制备防治阿尔茨海默病药物领域将具有广阔的应用前景。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 厦门大学

<120> 一种多肽用于制备防治阿尔茨海默病药物的用途

<130> XMDXN-19002-CNI

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Lys His Trp Gly Arg Arg Lys Ala Trp Cys Arg Gln Leu Gly Glu

Lys Gly Pro Cys Gln Arg Val Val Ser Thr His Asn Leu Trp Leu Leu

Ser Phe Leu Arg Arg Trp Asn Gly Ser

<210> 2

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgaagcact gggggaggcg caaggcctgg tgccgccagc tgggagagaa gggcccatgc 60

cagcgtgtgg tcagcacgca caacttgtgg ctgctgtcct tcctgaggag gtggaatggg 120

agc 123

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cggaattcat ggagcctctc cggctgc 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ccgctcgagt ttgggaaggg gatttctc 28

<210> 5

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atggagcctc tccggctgct catcttactc tttgtcacag agctgtccgg agcccacaac 60

accacagtgt tccagggcgt ggcgggccag tccctgcagg tgtcttgccc ctatgactcc 120

atgaagcact gggggaggcg caaggcctgg tgccgccagc tgggagagaa gggcccatgc 180

cagcgtgtgg tcagcacgca caacttgtgg ctgctgtcct tcctgaggag gtggaatggg 240

agcacagcca tcacagacga taccctgggt ggcactctca ccattacgct gcggaatcta 300

caaccccatg atgcgggtct ctaccagtgc cagagcctcc atggcagtga ggctgacacc 360

ctcaggaagg tcctggtgga ggtgctggca gaccccctgg atcaccggga tgctggagat 420

ctctggttcc ccggggagtc tgagagcttc gaggatgccc atgtggagca cagcatctcc 480

aggagcctct tggaaggaga aatccccttc ccacccactt ccatccttct cctcctggcc 540

tgcatctttc tcatcaagat tctagcagcc agcgccctct gggctgcagc ctggcatgga 600

cagaagccag ggacacatcc acccagtgaa ctggactgtg gccatgaccc agggtatcag 660

ctccaaactc tgccagggct gagagacacg tga 693

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cagagctgtc cggagccatg aagcactggg ggaggcg 37

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ccgctcgagt tgctcccatt ccacctcctc ag 32

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atggagcctc tccggctgct catcttactc tttgtcacag agctgtccgg agcc 54

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggctccggac agctctgtga caaagagtaa gatgagcagc cggagaggct ccat 54

设计图