stat1b基因突变对斑马鱼胚胎早期发育转录组调控的研究

论文摘要

信号转导与转录激活因子（STAT1）与多种细胞因子和生长因子的信号转导相关联,同时参与多种细胞功能的调节,例如参与调节免疫系统,抑制肿瘤细胞的增长,抑制细胞分化,促进细胞的凋亡。本实验室在前期分析了人类STAT1基因在低骨密度（BMD）中高表达,以及在stat1b突变品系斑马鱼中破骨细胞（OC）含量增加。斑马鱼与人类在遗传上和生理上都具有比较高的同源性,并且斑马鱼具有较强的基因编辑能力、世代时间较短和发育阶段比较快速等等特点,使得斑马鱼常被选定为研究对象。本研究运用高通量测序获得了有关于stat1b基因纯系突变品系和野生型斑马鱼的大量转录组数据,有助于人类从分子水平上对stat1b基因进行深入研究。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对斑马鱼stat1b基因进行了敲除。通过一系列实验,包括DNA基因组提取、目的片段的扩增、DNA纯化回收、T7核酸内切酶Ⅰ酶切、TA克隆和Sanger测序鉴定stat1b突变型斑马鱼并且成功获得了stat1b F3代纯合突变品系斑马鱼,建立了stat1b-/-突变模型。本文通过Illumina HiSeq平台分别对stat1b-S2基因纯合突变体和野生型斑马鱼的胚胎的1-细胞时期、2-细胞时期、4-细胞时期、8-细胞时期、16-细胞时期这五个细胞时期进行高通量测序,使用GO富集和KEGG通路来分析每个发育阶段胚胎的差异基因。结果显示,在stat1b纯合突变品系与野生型斑马鱼的胚胎的比较组合中,1-细胞时期、2-细胞时期、4-细胞时期、8-细胞时期、16-细胞时期分别筛选出4791、3623、4319、7648、7889个差异基因。突变体与野生型斑马鱼胚胎五个细胞时期的相互比较样品的前50个差异表达显著的基因中,fl1a基因表达为上调,adcy8基因和me3基因表达为下调。GO富集分析显示,在五个细胞时期的差异基因主要富集在代谢过程、细胞内组分等方面;KEGG通路富集分析结果表明,在五个细胞时期的差异基因主要与RNA转运、泛素介导的蛋白水解、蛋白质在内质网上的加工等通路相关联。根据结果数据分析,stat1b基因敲除后,使得斑马鱼胚胎早期发育过程中,eif4e2、eif3jb、senp2基因的表达下调,从而影响RNA转运通路。此外,分别对stat1b纯合突变品系和野生型斑马鱼每个细胞时期的比较组合的差异基因进行了初步的筛选,发现其大部分的差异基因与锌指蛋白相关,推测stat1b基因可能与细胞分化相关,从分子水平上揭示了stat1b基因突变伴随的相关生物学功能和通路所发生的变化。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
•   1.1 STAT1的概述
•     1.1.1 STAT1的结构
•     1.1.2 STAT1的激活
•     1.1.3 STAT1的生物学功能
•   1.2 模式生物斑马鱼
•   1.3 高通量测序技术
•   1.4 研究意义
• 2 材料和方法
•   2.1 材料
•     2.1.1 主要试剂
•     2.1.2 主要实验耗材和仪器
•     2.1.3 主要实验试剂的配方
•   2.2 方法
•     2.2.1 斑马鱼的养殖方法
•     2.2.2 筛选纯合突变体斑马鱼
•       2.2.2.1 筛选stat1b-S2 F2代纯合突变体斑马鱼
•       2.2.2.2 筛选stat1b-S2 F3代纯合突变体斑马鱼
•     2.2.3 采集与处理stat1b-S2 F3代斑马鱼胚胎样本
•     2.2.4 基因文库的构建与测序
•     2.2.5 转录组测序数据的分析
• 3 实验结果
•   3.1 筛选通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除的斑马鱼stat1b基因纯合突变品系
•   3.2 stat1b-S2 F3代纯合突变能型斑马鱼表型观察
•   3.3 生物信息分析
•     3.3.1 测序数据与质量评估
•     3.3.2 基因表达水平分析
•     3.3.3 RNA-Seq相关性分析
•     3.3.4 差异基因分析
•       3.3.4.1 差异基因的筛选
•       3.3.4.2 不同细胞时期的差异表达显著的基因
•       3.3.4.3 差异基因聚类分析
•       3.3.4.4 差异基因维恩图
•       3.3.4.5 差异基因GO富集分析
•       3.3.4.6 差异基因KEGG富集分析
•       3.3.4.7 基于差异表达基因的信号通路分析
• 4 讨论
•   4.1 stat1b-S2纯合突变品系斑马鱼的鉴定与确认
•   4.2 转录组差异表达总体分析
•   4.3 stat1b基因影响锌指蛋白相关基因
•   4.4 stat1b基因突变对RNA转运通路产生影响
• 5 全文小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 万思瑶

导师: 陈湘定

关键词: 斑马鱼,高通量测序

来源: 湖南师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 湖南师范大学

分类号: Q953

总页数: 120

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