空肠弯曲菌FlhF调节鞭毛合成分子机制及其对细菌毒力的影响分析

论文摘要

空肠弯曲菌是一种重要的食源性人兽共患病原菌,其可通过动物、食物、水、牛奶等传播给人,并引发以腹泻为主的急性胃肠炎等症状。近年来弯曲菌感染案例在世界各地普遍呈上升趋势,给公共卫生和食品安全带来严重威胁。鞭毛在空肠弯曲菌致病过程中发挥重要作用,其不仅介导细菌运动力,帮助黏附、侵袭细胞,定植宿主,还参与分泌毒力蛋白以及逃避宿主天然免疫应答;另外部分鞭毛因子还被发现可以协同调节该菌其他毒力基因表达,使得鞭毛成为空肠弯曲菌重要的致病因子。FlhF是近年来在极鞭毛细菌中发现调控鞭毛生成数目和定位的关键蛋白,FlhF在不同细菌鞭毛合成过程中发挥不一样的效应;在空肠弯曲菌中,FlhF突变使得细菌完全失去鞭毛结构以及运动力,但其作用机制目前还未阐明。本研究利用表达谱芯片技术在全基因水平分析了 FlhF所影响的代谢通路及其效应,并在鞭毛系统中探究了其所发挥的功能,同时还就FlhF突变对空肠弯曲菌毒力以及致腹泻能力的影响进行了分析;研究结果为深入解析FlhF的作用机制及其与该菌毒力的偶联性提供了依据。1.空肠弯曲菌flhF突变株全基因转录表达谱比较分析应用荧光定量PCR方法评价在不同生长阶段的空肠弯曲菌鞭毛基因的相对表达量,选取鞭毛基因表达相对旺盛的时间点进行表达谱芯片实验,分析FlhF在全基因水平的影响;对所获得的差异基因进行聚类以及富集分析,确定FlhF突变主要映射的代谢通路;收集空肠弯曲菌鞭毛以及其他毒力系统基因,分析FlhF在鞭毛合成通路内的效应,以及其对该菌其他毒力系统所发挥的协同调节作用。研究结果显示在体外培养20 h时空肠弯曲菌的生长状态良好,大部分鞭毛基因的相对表达量较高。对比空肠弯曲菌野生株和flhF突变株的表达谱数据,差异基因聚类分析表明FlhF突变后对空肠弯曲菌基因表达谱产生了明显影响;以差异倍数大于2,p值小于0.01设为阈值进行筛选,总计获得10个差异表达基因,对差异基因进行Gene Ontology和Pathway分析,发现鞭毛及其介导的运动力是显著受影响的通路。在鞭毛通路中进行深入分析发现FlhF在鞭毛系统中发挥一种总调节子功能,其突变后64%的鞭毛相关基因都呈现下调表达;该效应从鞭毛合成早期就开始体现,并持续到鞭毛合成晚期;将鞭毛基因按照其功能相关性以及转录级联层次进行分类,显著性分析结果表明鞭毛丝相关基因以及Ⅲ类鞭毛基因的转录相较其他基因是显著下调表达的。空肠弯曲菌鞭毛基因散布于基因组中,利用基因表达谱数据,本研究发现FlhF突变协同使该菌60%的趋化基因、51.4%的荚膜多糖基因、31.8%的脂寡糖基因、16.7%的铁离子摄取基因、52%的黏附侵袭基因以及39.2%的定植基因呈现下调表达;显著性分析表明FlhF对空肠弯曲菌定植、黏附侵袭和趋化基因表达的影响要显著高于铁离子摄取、脂寡糖和荚膜多糖成分。2.FlhF影响空肠弯曲菌鞭毛合成分子机制研究测定FlhF的相对表达量并观察其亚细胞定位,分析FlhF蛋白的生物学特性;利用荧光示踪技术研究FlhF对其他鞭毛亚单位胞内定位的介导能力,分析空肠弯曲菌鞭毛合成被阻断的机制;通过免疫共沉淀实验结合GSTpull-down验证,筛选并分析FlhF蛋白在胞内可能的作用靶点及其互作结构域;利用凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）探究FlhF是否具有转录调控功能。结果显示FlhF在空肠弯曲菌中是以Ⅰ类鞭毛基因的形式持续性表达的,FlhF主要定位于空肠弯曲菌鞭毛初始着生的细胞极端内膜组分中,说明其可能在鞭毛合成早期发挥作用。FlhF突变后FlhB-GFP和FlgB-GFP均不能再定位于细胞极端,表明鞭毛输出系统组装以及运输功能均受到明显影响,空肠弯曲菌鞭毛组装从而被阻断在合成早期。互作蛋白筛选结果表明FlhF可能与鞭毛组装、趋化、信号识别颗粒、转录翻译、代谢相关蛋白存在功能联系,进一步验证发现FlhF在胞内与FlhG,CheA,DnaK和GlyA有直接相互作用;FlhF蛋白自身可以分为B、N、G三个结构域,结果显示N结构域是FlhF与其他蛋白互作的结构基础;FlhG被发现与FlhF的B结构域有最强的结合作用;GlyA与FlhF二聚体一样通过与其NG结构域结合来互作;CheA和DnaK被发现只与FlhF的N结构域结合。在鞭毛合成三个级联系统中随机选取10个基因的启动子序列进行EMSA验证,发现FlhF可以与调节鞭毛基因转录的sigma因子（σ70和σ28）的启动子序列结合,说明FlhF可以作为转录因子直接调控鞭毛基因转录,影响Ⅰ类和Ⅲ类鞭毛基因的表达。3.FlhF突变对空肠弯曲菌毒力以及致腹泻能力的影响利用分子生物学方法构建flhF突变株以及回复株,评价FlhF突变对空肠弯曲菌毒力以及致腹泻能力的影响。结果显示与野生株相比,flhF突变株只能在接种处生长,完全失去了运动力;其正常鞭毛表型从94%下降为0%,并且不能在电子显微镜视野中观察到鞭毛结构。FlhF突变后空肠弯曲菌的自凝集以及生物被膜形成能力显著降低;利用三种趋化物对菌株的趋化性进行分析,发现flhF突变株在DL-苹果酸和α酮戊二酸诱导体系中的趋化性显著低于野生株。在对Caco-2细胞的黏附、侵袭过程中,FlhF突变使得突变株的相对黏附、侵袭率分别下降为野生株的20.15%和2.90%;通过离心处理尽量排除运动力影响因素后,其相对黏附率可回复至74.78%,但对侵袭能力的修复却没有明显效果,仍只有野生株水平的3.09%;说明flhF突变株对细胞的黏附缺陷主要由运动力丧失导致,而侵袭能力的降低更可能是由鞭毛缺失引起。以鸡和小鼠分别代表禽类和哺乳类研究了 FlhF突变对空肠弯曲菌定植能力的影响。在攻毒后1天,flhF突变株在鸡除结肠外的所有肠道组织中的定植量均显著低于野生株,而在小鼠中则未观察到显著性差异,说明FlhF对空肠弯曲菌在不同宿主中建立初始定植的影响不一;在攻毒后7天,发现空肠弯曲菌野生株可以在鸡和小鼠中持续定植,而flhF突变株则全部被小鼠清除出体外,在鸡中的情况也很相似,flhF突变株仅在一只鸡的盲肠中被分离到,细菌载量也只有104CFU（Colony forming units）/g;说明FlhF对于空肠弯曲菌在宿主体内持续定植的重要性。通过空肠弯曲菌感染仔兔动物模型比较了不同菌株之间的致腹泻能力的差异,结果显示在攻毒后1,2,3天flhF突变株感染仔兔引发的腹泻严重程度均低于野生株。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 综述 空肠弯曲菌毒力因子及鞭毛介导的协同调节毒力机制
•   1 空肠弯曲菌的生物学特性及流行特征
•   2 空肠弯曲菌的传播及感染机制
•   3 空肠弯曲菌典型毒力因子
•     3.1 鞭毛运动
•     3.2 趋化性
•     3.3 脂寡糖
•     3.4 荚膜多糖
•     3.5 铁离子摄取系统
•     3.6 黏附侵袭
•     3.7 定植
•     3.8 细胞致死性肿胀毒素
•   4 空肠弯曲菌鞭毛介导的协同调节毒力机制
•     4.1 鞭毛与空肠弯曲菌感染力
•     4.2 三型分泌系统功能
•     4.3 鞭毛协同调节的毒力因子
•     4.4 糖基化修饰作用
•   5 结语
•   参考文献
• 第一章 空肠弯曲菌flhF突变株全基因转录表达谱比较分析
•   1 材料
•     1.1 菌株
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器设备
•   2 方法
•     2.1 细菌培养
•     2.2 生长曲线测定
•     2.3 细菌RNA的提取
•     2.4 cDNA的合成
•     2.5 实时荧光定量PCR
•     2.6 基因表达谱芯片
•     2.7 差异表达基因的筛选及分析
•     2.8 空肠弯曲菌毒力基因整理
•   3 结果
•     3.1 空肠弯曲菌鞭毛系统生物信息学分析
•     3.2 空肠弯曲菌鞭毛基因在不同生长阶段表达情况
•     3.3 Microarry分析FlhF突变对空肠弯曲菌基因表达谱的影响
•     3.4 FlhF在空肠弯曲菌鞭毛系统中的效应分析
•     3.5 FlhF对空肠弯曲菌毒力系统的协同影响
•   4 讨论
•   参考文献
• 第二章 FlhF影响空肠弯曲菌鞭毛合成的分子机制研究
•   1 材料
•     1.1 菌株与质粒
•     1.2 主要试剂
•     1.3 主要仪器设备
•     1.4 引物设计及多肽合成
•   2 方法
•     2.1 反转录PCR
•     2.2 细菌质膜组分粗分离
•     2.3 免疫印迹分析
•     2.4 激光共聚焦显微镜观察
•     2.5 免疫共沉淀
•     2.6 蛋白原核表达及纯化
•     2.7 GST pull-down实验
•     2.8 凝胶迁移实验
•   3 结果
•     3.1 flhF所处的鞭毛基因位点及其相对表达量分析
•     3.2 FlhF蛋白在空肠弯曲菌中亚定位观察
•     3.3 FlhF突变对空肠弯曲菌鞭毛组件定位的影响
•     3.4 Co-IP筛选与FlhF相互作用的蛋白
•     3.5 GST pull-down验证FlhF蛋白互作结果
•     3.6 FlhF与互作蛋白的作用结构域分析
•     3.7 EMSA验证FlhF蛋白转录调控功能
•   4 讨论
•   参考文献
• 第三章 FlhF突变对空肠弯曲菌毒力以及致腹泻能力的影响
•   1 材料
•     1.1 菌株、细胞与质粒
•     1.2 实验动物
•     1.3 主要试剂
•     1.4 主要仪器设备
•   2 方法
•     2.1 空肠弯曲菌flhF突变株以及回复株的构建
•     2.2 运动力以及电子显微镜观察
•     2.3 细菌自凝集以及生物被膜检测
•     2.4 空肠弯曲菌趋化性分析
•     2.5 细胞黏附、侵袭实验
•     2.6 定植实验
•   3 结果
•     3.1 空肠弯曲菌flhF突变株及回复株的构建与鉴定
•     3.2 FlhF突变对空肠弯曲菌鞭毛及运动力的影响
•     3.3 FlhF对空肠弯曲菌自凝集以及生物被膜形成能力的影响
•     3.4 FlhF对空肠弯曲菌趋化性影响分析
•     3.5 FlhF对空肠弯曲菌黏附、侵袭能力的影响
•     3.6 FlhF对空肠弯曲菌在鸡和小鼠体内的定植影响分析
•     3.7 FlhF在空肠弯曲菌感染仔兔并致腹泻过程中的作用分析
•   4 讨论
•   参考文献
• 全文总结
• 附录 Microarry分析FlhF突变空肠弯曲菌毒力系统基因表达变化
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文目录

文章来源

类型: 博士论文

作者: 任方哲

导师: 焦新安,黄金林

关键词: 空肠弯曲菌,鞭毛合成,毒力,定植

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

分类号: S852.61

总页数: 142

文件大小: 14010K

下载量: 175