小鼠胚胎干细胞定向血管内皮和造血细胞分化体系的建立

论文摘要

研究背景:在血管发生和重塑的过程中,血管内皮细胞（endothelial cell,EC）起源于血液血管母细胞（hemangioblast,HA）。但由于缺乏对这一发育过程诸多细节的深入了解,因而成熟的血管内皮在体外扩增十分困难,极大地限制了它的功能研究和临床应用。近年来,多项研究表明哺乳动物成体血管内皮中存在一群具有特定分子表型的“血管内皮干细胞（vascular endothelial stem cell,VESC）”,表达Kit（也称CD117）、Procr（也称EPCR、CD201）等分子,能在体外形成稳定克隆并产生数千万的子代内皮细胞。不仅如此,VESC还具有分化为原代内皮细胞和周细胞的双向潜能,可以在体内产生功能性血管,这为组织工程化血管和临床治疗提供了新的研究方向。造血细胞（hematopoietic cell,HC）的起源与血管内皮密不可分。目前的主流观点认为,造血细胞是由中胚层来源、功能特化的生血内皮（hematopoietic endothelium,HE）通过内皮-造血转化（endothelial to hematopoietic cell transition,EHT）分化演变而来,以产生原始造血和定向造血两大主要形式出现于胚胎早期的多个位点和时间节点,具有明显的时空特异性。小鼠胚胎期的造血细胞表达内皮细胞标志CD31、CD144等,来自外周血CD34+的造血细胞可以通过体外培养分化为内皮细胞,这些研究也间接证实了造血细胞与内皮细胞有着共同的发育起源。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）是一类能够分化成机体几乎所有细胞类型的全能干细胞,增殖能力强,是组织工程化研究理想的种子细胞。近年来多项研究表明,在干细胞因子（stem cell factor,SCF）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、白细胞介素3（interleukin-3,IL-3）、促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）等细胞因子的诱导下,ESC在体外能被诱导分化为内皮干祖细胞（endothelial stem and progenitor cell,ESPC）,进而分化成内皮细胞、血管壁细胞（周细胞和血管平滑肌）并进一步向动、静脉内皮特化;或者分化为造血干祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC）,进而向髓系祖细胞（myeloid progenitor）、巨核-红系祖细胞（megakaryocyte–erythrocyte progenitor,MEP）等及其下游血细胞分化。这些发现为ESC的体外诱导编辑研究奠定了理论基础,然而因诱导手段局限、调控网络不清晰、微环境缺失等原因,ESC体外定向内皮细胞和造血细胞的分化体系仍不十分成熟。研究目的:本研究利用胚胎干细胞的发育全能性和诱导可塑性,通过各种细胞因子和条件控制,定向诱导其分别向内皮细胞和造血细胞分化,构建完整的体外定向分化体系。通过流式检测、免疫组化等各种手段验证诱导后2种细胞的表面分子特征,探索诱导过程中是否存在“干祖细胞”的中间态及其表面分子特征,探讨内皮和造血发育的相关性,为优化稳定、成熟的体外诱导分化体系,进而进行大规模组织工程化应用研究提供实验基础。研究方法:根据胚胎期内皮、造血细胞的起源规律,本研究在无血清的StemPro培养体系中,使用能够诱导干细胞向中胚层分化的BMP4（bone morphogenetic protein 4,骨形态发生蛋白4）、Activin A（激活素-A）,以及能够诱导内皮细胞增殖、迁移的FGF-Basic（fibroblast growth factor basic,碱性成纤维细胞生长因子）和VEGF这4种因子,诱导小鼠胚胎干细胞系R1/E形成拟胚体（embryoid body,EB）,模拟中胚层发育过程,再用SCF、VEGF和SCF、FLt3L（FLt-3 ligand）、IL-3分别定向诱导EB向EC和HC分化,建立胚胎干细胞体外定向血管内皮和造血细胞的分化系统。研究结果:经过四因子体系诱导分化4天后,ESC成功被诱导为大量形态饱满、克隆边界清楚的EB;继续向内皮和造血定向分化6天后,成功诱导出多个内皮管状结构和造血集落。通过流式检测分析,CD31+的内皮细胞比例为1.35±0.05%,进一步分析CD31+CD144+CD45-群体,发现其中有3.0±0.2%的细胞表型为Kit+CD201+,提示该部分细胞可能是处于分化上游的ESPC;CD45+的造血细胞比例为35.0±0.5%,其中有0.35±0.05%的细胞表型为Kit+CD201+,提示该部分细胞可能是处于分化上游的HSPC。这两群细胞数量非常有限,但具有非常典型的干祖细胞特征标记,且表型相似,间接印证了内皮细胞和造血细胞有着共同的命运起源,与既往的研究认识不谋而合。研究结论:本研究成功地建立了将胚胎干细胞体外定向内皮细胞和造血细胞分化的体系,间接验证了二者可能存在共同的胚胎起源,并且通过流式检测捕捉到具有内皮、造血干祖细胞分子特征的细胞,可作为良好体外诱导分化体系,为深入探讨内皮、造血细胞的发育调控机制及以胚胎干细胞体外大规模定向诱导分化奠定了实验基础。

论文目录

• 缩略语表
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 胚胎干细胞体外定向中胚层祖细胞分化
•   1.1 实验流程
•   1.2 材料与方法
•     1.2.1 实验动物与材料
•     1.2.2 实验方法
•   1.3 结果
•     1.3.1 胚胎干细胞诱导4 天后形成大量拟胚体克隆
•     1.3.2 胚胎干细胞体外定向中胚层细胞分化方法的建立
•   1.4 小结
•     1.4.1 无血清诱导体系能够促进胚胎干细胞向中胚层分化
•     1.4.2 拟胚体经诱导可获得中胚层祖细胞标记
• 第二章 中胚层祖细胞体外定向血管内皮细胞分化
•   2.1 实验流程
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 实验方法
•   2.3 结果
•     2.3.1 拟胚体定向诱导出典型内皮细胞结构
• +内皮细胞中存在少量表达干祖细胞特征的群体'>    2.3.2 CD31⁺内皮细胞中存在少量表达干祖细胞特征的群体
• +CD201⁺内皮细胞稳定存在于内皮诱导体系中'>    2.3.3 Kit⁺CD201⁺内皮细胞稳定存在于内皮诱导体系中
•   2.4 小结
•     2.4.1 双因子分化体系能够诱导出结构化的血管内皮细胞
• +CD201⁺表型的内皮干祖细胞稳定存在于内皮诱导体系'>    2.4.2 Kit⁺CD201⁺表型的内皮干祖细胞稳定存在于内皮诱导体系
• 第三章 中胚层祖细胞体外定向造血细胞分化
•   3.1 实验流程
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 实验材料
•     3.2.2 实验方法
•   3.3 结果
•     3.3.1 拟胚体定向诱导出造血克隆
• +造血祖细胞中同样存在少量表达干祖细胞特征的群体'>    3.3.2 CD45⁺造血祖细胞中同样存在少量表达干祖细胞特征的群体
• +CD201⁺群体普遍存在于内皮和造血诱导体系'>    3.3.3 Kit⁺CD201⁺群体普遍存在于内皮和造血诱导体系
•   3.4 小结
•     3.4.1 三因子分化体系能够稳定地诱导出造血克隆
• +CD201⁺表型同样可以捕获造血干祖细胞'>    3.4.2 Kit⁺CD201⁺表型同样可以捕获造血干祖细胞
• 第四章 讨论与展望
• 第五章 结论
• 参考文献
• 作者在学期间取得的学术成果
• 附件
• 主要简历
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 郝俊凯

导师: 刘兵

关键词: 胚胎干细胞,分化,内皮细胞,造血细胞,血管内皮干祖细胞,造血干祖细胞

来源: 军事科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 军事科学院

分类号: R329.2

总页数: 84

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