食源性病原菌多粘菌素耐药基因的耐药机制研究

论文摘要

近年来,随着抗生素在牲畜养殖和临床治疗中的大量使用,微生物的耐药问题逐渐受到了世界范围内食品安全和公共卫生领域的广泛关注,特别是碳青霉烯类抗生素耐药菌株的出现,直接导致了人们在面对多重耐药菌株时出现了“无药可用”的尴尬境地。在这样一种严峻的背景下,多肽类抗生素多粘菌素开始受到越来越多的关注,多粘菌素对于革兰氏阴性细菌具有杀菌和抑菌作用,特别是针对越来越频繁出现的碳青霉烯类多重耐药菌株。但是从2016年开始由质粒介导多粘菌素耐药基因mcr-1及其同源基因不断的被报道出来,使得多粘菌素这一防线受到严重威胁。因此,对mcr-1阳性菌株的耐药性和mcr-1及相关家族基因耐药机制的研究,对于多粘菌素耐药细菌的防控具有十分重要的意义。本论文主要从以下几个方面进行研究:mcr-1阳性耐药菌株的筛选及其耐药性分析;建立针对5个mcr家族基因的多重PCR检测方法,并且对该方法的特异性、敏感性进行验证;mcr-5基因相关工程菌株构建和其耐药机制研究。本论文的主要研究结果如下:（1）mcr-1基因阳性大肠杆菌筛选及其耐药性分析。从来自巴基斯坦费萨拉巴德区养鸡场肉鸡粪便中分离出8株多粘菌素耐药菌株,经过形态学、生理生化及分子生物学鉴定,8株菌均为mcr-1阳性大肠杆菌,菌株编号分别为:PK102、PK103、PK105、PK107、PK109、PK110、PK111、PK112。8株耐药菌株的多粘菌素最小抑菌浓度（MIC）为28μg/mL,最小杀菌浓度（MBC）为416μg/mL。8株耐药菌株中,含mcr-1基因的质粒可分为两种类型,且均不含ISApl1插入元件。8株耐药菌株分属于ST10、ST2847、ST155、ST361、ST6395以及两个新的多位点序列分型（MLST）。耐药菌株PK105基因组测序结果显示,mcr-1基因位于一个60499 bp的IncI2型质粒上,该质粒含有一系列与接合转移有关的vir和pil家族基因。通过耐药菌株PK105的脂质A的基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析结果显示,含有一个1797.122（m/z）峰的同时,还有一个1920.136（m/z）的修饰峰。PK102、PK103、PK109、PK112、PK113菌株对12种抗生素均为耐药或中介耐药,PK105菌株对哌拉西林敏感,对其余11种抗生素为耐药或中介耐药,PK107菌株对庆大霉素敏感,对其余11种抗生素为耐药或中介耐药,PK110菌株对头孢他啶、头孢唑林敏感,对其余10种抗生素为耐药或中介耐药。（2）mcr家族基因的多重PCR检测方法的建立。针对5个mcr家族基因mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5,设计5对PCR产物长度范围在219908 bp的特异性引物,设定相应PCR反应程序,构建针对5个mcr家族基因的多重PCR检测方法。通过以单个含mcr基因的质粒和多重混合含mcr基因的质粒为模板进行检测,验证了该检测方法的特异性和灵敏性。对156株野生型菌株进行检测,验证了该检测方法在实际运用中的有效性。同时对野生型菌株进行了关于mcr-7、mcr-8基因的检测。（3）多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药机制研究。构建有关多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药功能菌株MG1655和蛋白表达菌株BL21,以此为试验对象。经过SWISS-MODEL的生物信息预测,得到磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的12个关键氨基酸位点,构建相应位点突变菌株,通过多粘菌素最小抑菌浓度、脂质A修饰和western blot的检测,得知这12个氨基酸位点均对MCR-5的酶活作用起到重要功能。对磷酸乙醇胺转移酶MCR-1、MCR-2、MCR-5蛋白的胞外区域和跨膜区域进行预测,构建相应蛋白的胞外与跨膜互换菌株,通过对胞外与跨膜互换菌株的多粘菌素耐药功能检测。氨基酸序列相似度为81%的MCR-1与MCR-2的胞外与跨膜互换菌株仍然保留了耐药功能,而MCR-5与MCR-1/MCR-2的氨基酸序列相似度均小于35%,所以MCR-5与MCR-1/MCR-2的蛋白胞外与跨膜区域互换后,该菌株失去了耐药功能。对磷酸乙醇胺转移酶MCR-5进行体外表达纯化和酶活检测,验证了其进行磷酸乙醇胺修饰以产生耐药功能的机制。利用激光共聚焦显微镜观察和“化合物拯救”试验可知,多粘菌素可以通过刺激细菌在胞内产生活性氧以达到杀菌的目的,而耐药基因mcr-5的存在可减少多粘菌素引起的活性氧产生,从而使菌株对多粘菌素产生耐药性。此外,验证了mcr-5耐药基因表达对菌株生长的影响,比较了5个mcr家族基因的MG1655菌株的多粘菌素耐药水平高低。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 研究背景
•   1.1 食源性病原菌简介
•   1.2 多粘菌素的发现与应用
•   1.3 多粘菌素的抗菌机制
•   1.4 多粘菌素耐药机制的研究现状
•     1.4.1 脂多糖的修饰作用
•     1.4.2 多粘菌素的外排泵机制
•     1.4.3 生物膜机制
•   1.5 质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的研究现状
•     1.5.1 mcr-1基因的研究现状
•     1.5.2 mcr家族基因的研究现状
•   1.6 研究目的与意义
• 2 mcr-1基因阳性大肠杆菌筛选及其耐药性分析
•   2.1 前言
•   2.2 材料与设备
•     2.2.1 试验材料
•     2.2.2 试剂与药品
•     2.2.3 培养基及缓冲液的配置
•     2.2.4 仪器与设备
•   2.3 试验方法
•     2.3.1 样品采集及菌株分离
•     2.3.2 耐药菌株的生化及分子鉴定
•     2.3.3 耐药菌株的多粘菌素耐药水平检测
•     2.3.4 耐药菌株的mcr-1基因及质粒多样性检测
•     2.3.5 耐药菌株MLST分型检测
•     2.3.6 耐药菌株PK105基因组检测及序列组装
•     2.3.7 耐药菌株PK105的脂质A提取纯化及MALDI-TOF质谱分析
•     2.3.8 耐药菌株对其他抗生素耐药水平的初步检测
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 耐药菌株的鉴定结果
•     2.4.2 耐药菌株对多粘菌素的耐药性
•     2.4.3 耐药菌株的mcr-1基因鉴定及mcr-1质粒载体多样性
•     2.4.4 mcr-1阳性菌株的MLST分型及其流行性
•     2.4.5 mcr-1阳性菌株PK105的质粒基因组图谱
•     2.4.6 mcr-1阳性菌株PK105脂质A的化学修饰
•     2.4.7 mcr-1阳性菌株的广谱耐药性
•   2.5 小结
• 3 mcr家族基因的多重PCR检测方法的建立
•   3.1 前言
•   3.2 材料与设备
•     3.2.1 试验材料
•     3.2.2 试剂与药品
•     3.2.3 培养基及缓冲液的配置
•     3.2.4 仪器与设备
•   3.3 试验方法
•     3.3.1 引物设计
•     3.3.2 DNA模板制备
•     3.3.3 多重PCR反应体系设计
•     3.3.4 PCR产物测序
•     3.3.5 多重PCR反应体系特异性及敏感性检测
•     3.3.6 野生型菌株mcr基因的检测
•   3.4 结果与讨论
•     3.4.1 多重PCR产物序列鉴定结果
•     3.4.2 多重PCR反应体系的特异性及敏感性
•     3.4.3 多重PCR反应体系对野生菌株检测的有效性
•   3.5 小结
• 4 多粘菌素耐药基因mcr-5的耐药机理研究
•   4.1 前言
•   4.2 材料与设备
•     4.2.1 试验材料
•     4.2.2 试剂与药品
•     4.2.3 培养基及缓冲液的配置
•     4.2.4 仪器与设备
•   4.3 试验方法
•     4.3.1 mcr-5耐药功能菌株与蛋白表达菌株的克隆与构建
•     4.3.2 MCR-5 的蛋白结构预测
•     4.3.3 mcr-5功能位点突变菌株构建及耐药功能验证
•     4.3.4 MCR-5与MCR家族蛋白功能区域互换菌株构建及其耐药功能验证
•     4.3.5 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的蛋白表达、纯化及鉴定
•     4.3.6 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外酶活反应
•     4.3.7 mcr-5功能菌株活性氧的激光共聚焦显微镜观察及化学拯救试验
•     4.3.8 mcr-5的诱导表达对菌株生长状态的影响检测
•     4.3.9 不同mcr家族基因的MG1655菌株多粘菌素最小抑菌浓度检测
•   4.4 结果与讨论
•     4.4.1 mcr-5耐药功能菌株与蛋白表达菌株
•     4.4.2 MCR-5 蛋白结构预测结果
•     4.4.3 mcr-5功能位点突变菌株的耐药功能分析
•     4.4.4 mcr-5与其他mcr家族基因蛋白功能区域互换菌株的耐药功能分析
•     4.4.5 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外纯化与蛋白鉴定结果
•     4.4.6 磷酸乙醇胺转移酶MCR-5的体外酶活催化
•     4.4.7 由活性氧介导的多粘菌素杀菌途径
•     4.4.8 mcr-5耐药基因的表达对菌株生长的影响
•     4.4.9 不同mcr家族基因的多粘菌素耐药性
•   4.5 小结
• 5 结论、创新点与展望
•   5.1 结论
•   5.2 创新点
•   5.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 雷晟

导师: 吕嘉枥,冯友军

关键词: 大肠杆菌,菌株筛选,多粘菌素耐药基因,耐药机制,磷酸乙醇胺修饰

来源: 陕西科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 陕西科技大学

分类号: TS201.3

总页数: 99

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