李莹1，张建华2，郭蕾1，张晓梅1，毛红岩1
（1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007）
摘要：目的：探讨在缺氧以及缺氧后复氧条件下，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的作用。方法：饲养SPF级SD大鼠，雌雄配对生产后，取出生24h内的SD乳鼠并处死，取乳鼠分离出海马，无菌条件下制成悬液。经过培养以及传代、鉴定后，取第4代神经干细胞（NSCs）作为实验对象。用氯化钴制备缺氧、缺氧/复氧模型，实验分为常氧对照组、缺氧组、缺氧/复氧组，每组在4h、8h、12h、16h后分别行NSCs形态学观察，NSCs的增殖变化，iNOSmRNA的表达，以及组织学观察。结果：缺氧条件以及缺氧/复氧条件下iNOSmRNA均有不同程度的表达，缺氧8h时iNOSmRNA表达最多，此时神经干细胞增殖数量达到最高值。缺氧/复氧8h后iNOSmRNA减少。随着iNOSmRNA表达量减少，神经干细胞增殖数目也随之减少。结论：iNOS的表达与神经干细胞增殖呈正相关，对神经干细胞增殖起一定的作用。
关键词：低氧诱导因子；SD大鼠；增殖
【中图分类号】R329【文献标识码】A
NOS最重要的同工酶iNOS，在机体活动中不表达，如果机体内环境发生变化，如细胞由于某种原因处在缺氧状态下，可以促使机体产生。NSCs在缺氧状态下，可以使细胞损伤，从而促进机体产生诱导型一氧化氮合酶，但具体其对NSCs产生多大影响，现今研究的并不清楚，故本实验研究机体在缺氧条件下，iNOS表达对神经干细胞的作用。
1材料与方法
1.1实验动物
SPF级SD大鼠及出生24h内的乳鼠
12实验方法
1.2.1制备细胞悬液传代后鉴定神经干细胞
将饲养8周的SD大鼠雌雄配对，并将出生24h内的乳鼠处死，无菌下开颅取出大脑组织，仔细分离条状海马组织，立即放入Hank’s缓冲液中，漂洗满意后放入DMEM/F12培养瓶中。将海马条状组织制成约1㎜3小块，吸管吹打使溶液呈细胞悬液状态后植入培养瓶内。
原代培养：在神经干细胞悬液培养瓶内加入bFGF20ng/mL、EGF20ng/mL和2%B27的DMEM/F12培养液，培养箱培养，2-3天将培养瓶半量换液，1周传代1次。
传代培养：将原代7天的细胞悬液离心收集，经过吸管吹打、分离，2-3天换半量液继续培养。
鉴定：取第4代神经干细胞，经过离心、PBS洗涤、吹打、种植、固定后，加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子，1天后Nestin免疫组化鉴定神经干细胞。
1.2.2氯化钴缺氧模型以及去氯化钴缺氧/复氧模型的建立
NSCs加入150μmol/L的CoCl2溶液，制备成神经干细胞缺氧状态模型，4h后去除CoCl2制备复氧模型。
1.2.3PCR检测各组神经干细胞iNOSmRNA的表达水平
将各组的NSCs离心、沉淀、收集后在经过溶解、定量、去除杂质及污染DNA,设计引物，再经过变性反应退火沉积，并加入反转录反应液。扩增iNOS、GAPDH产物进行电泳实验，出现反应条带，电脑成像分析表达量。
1.3统计学分析：
SPSS13.0系统统计并计量实验数据，同时用x±s表示。
2结果
2.1免疫组化鉴定干细胞
制备成细胞悬液，细胞聚集成团块状，吹打、沉积、原代培养3天时，干细胞球呈悬浮状，团块不规则呈半透明状。继续传代培养后，细胞数量显著增多，免疫组化细胞表达Nestin(见图1)。
图2常氧、缺氧、复氧组不同时间条件下神经球数量(免疫组化染色，×100)
2.3iNOSmRNA在缺氧、缺氧/复氧下表达的变化
iNOSmRNA在3组中，都有表达（见图3）。在分子量为459bp出现DNA条带，缺氧组中分析灰度值（iNOS/GADPH），与常氧组比较，iNOS/GADPH显著升高，P＜0.05（见表1））。iNOSmRNA在缺氧8h时表达量最多。其后，iNOSmRNA的表达渐减少。在缺氧后复氧下，iNOSmRNA的表达量渐减少，幅度不明显。
3讨论
氧是维系生命的基础，生命体的各种功能要靠氧来调节，如果生命体的氧含量发生变化，机体的功能也会随之改变。缺氧下，由于供氧量减少，导致神经细胞损伤，但在重新复氧条件下，会进一步加重神经细胞的损伤，机体内微环境各种因子在氧含量的变化中起到什么作用，至今仍处于初级阶段。现今，神经干细胞从发现到深入研究已取得很多成就，但对神经干细胞内的各种影响因子的作用以及参与机制并不十分清楚，所以并不能对神经损伤患者提高有效的治疗。机体内低氧诱导因子参与调节作用，研究此因子也获得了较大的成果，但诱导型一氧化氮合酶对缺氧以及复氧状态下神经干细胞的研究还很表面，并不深入。故本实验采用PCR方法检测NOS的表达，研究其对NSCs增殖的关系。氯化钴可以与氧争夺细胞表面靶点，从而使细胞与氧隔绝，用氯化钴来模拟神经细胞缺氧，进一步来研究因子的表达以及细胞增殖的影响。已研究的成果证明，机体在缺氧状态下，会诱导产生诱导型一氧化氮合酶，其与氧自由基反应生成过氧化硝基等化合物，从而损伤机体组织。
实验结果显示：神经干细胞在缺氧8h时，神经干细胞数量达到最多，是常氧组的2倍，8小时后，神经干细胞数量曲线平缓下降。复氧后，NSCs数量进一步降低，12h后基本恒定。PCR结果显示：iNOSmRNA在3组中均有表达，其扩增产物在缺氧组中灰度值最高，明显高于其他2组，p＜0.05。在缺氧8h时iNOSmRNA表达最大，以后逐渐降低。复氧后诱导型一氧化氮合酶对NSCs的增殖起到调节作用，可为以后的NSCs深入研究提供方向及新思路。
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基金项目：黑龙江省卫生厅科研课题，编号：2012-215。
作者简介：陆洪军（1970-）男，黑龙江桦南人，硕士，副主任医师。
通讯作者：李长德(1958～)男，黑龙江桦南人，学士，主任医师，硕士研究生导师。