检测猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性和经典毒株可视化RT-LAMP方法的建立

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是目前影响养猪业的重要病毒之一,国内PRRSV是以美洲型为主,根据致病性的强弱又可分为高致病性（HP）和经典性PRRSV毒株,高致病性PRRSV是引起国内2006年"猪高热病"的主要病原。PRRSV属于条件性致病病毒,对PRRSV感染猪和发病猪的准确、快速检测是采取有效措施的前提和依据。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种敏感、快速、操作相对简便的核酸扩增技术,整个反应在单一温度下进行,反应结果可以通过肉眼观察,在动物病原检测方面应用较多。本试验通过GenBank获得了HP-PRRSV和经典PRRSV分离株序列,选择2种毒株共同的保守基因区段,设计了用于检测PRRSV的RT-LAMP引物。通过对反应体系、反应温度、特异性、敏感性等优化,建立了检测PRRSV的RT-LAMP方法。建立的方法总体系为25μL,外引物终浓度为0.20μmol/L、内引物终浓度为1.60μmol/L,63.0℃恒温作用1 h,给反应产物中加入1μL SYBR GreenⅠ,阳性结果呈绿色,紫外光下可见荧光,阴性结果呈橙色,紫外光下无荧光。方法对PRRSV RNA的最低检测质量浓度为9.44×10-5 mg/L。用建立的方法对临床送检的19份猪样品（血清和组织）进行检测,与国标（GB/T 27517-2011）的HP-PRRSV和PRRSV双重RT-PCR检测方法进行对比,双重RT-PCR方法检测出6份阳性,RT-LAMP方法检测出8份阳性。本试验建立了检测PRRSV经典毒株和高致病毒株的RT-LAMP方法,为PRRSV的检测提供了可选择的方法。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 疫苗、病毒及临床样品
•   1.2 主要试剂
•   1.3 引物设计与合成
•     1.3.1 RT-LAMP引物设计与合成
•     1.3.2 PRRSV RT-PCR引物设计与合成
•   1.4 疫苗、血清、组织中总RNA的提取
•   1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP反应及结果观察
•   1.6 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP特异性试验
•   1.7 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP敏感性试验
•   1.8 临床样品检测
• 2 结果
•   2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP引物的PCR结果
•   2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP产物的观察
•   2.3 RT-LAMP方法特异性分析
•   2.4 RT-LAMP方法敏感性分析
•   2.5 临床样品检测
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 王凯,杨飞,罗丽华,王韦华,李鑫鑫,周宏超,范志新,田昊伦,冯全文,郭抗抗

关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,逆转录环介导等温核酸扩增,病毒检测

来源: 中国兽医学报 2019年09期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学动物医学院,渭南职业技术学院

基金: 陕西省重点农业科技示范推广项目(ZDKJ-2014-33),陕西省农业科技创新转化项目(NYKJ-2015-021),2016年度杨凌示范区农业科技示范推广能力提升项目(TS-2016-12)

分类号: S852.651

DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2019.09.02

页码: 1660-1666+1673

总页数: 8

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