类聚异戊二烯产物基因工程菌的构建

论文摘要

类聚异戊二烯产物一类以焦磷酸异戊二烯酯聚合形成的聚合产物,类聚异戊二烯产物包括低聚产物和高聚产物,其都有很广泛的应用价值。低聚产物如角鲨烯作为保湿剂和润肤剂广泛用于化妆品中,并有多种促进健康的功能,包括抑制肿瘤,增强免疫力等作用。高聚产物如聚异戊二烯作为天然橡胶主要应用于制造轮胎、胶乳、胶鞋、胶带等。但目前两者在大量生产上都受到限制,因此开发类聚异戊二烯产物的合成生物方法具有重要的应用价值。本课题在合成生物学的基础上进行代谢工程的构建,主要是以大肠杆菌为宿主菌,构建甲羟戊酸途径（MVA pathway）的完整途径。通过微生物细胞来生产目标产物角鲨烯和聚异戊二烯。本课题主要工作:（1）甲羟戊酸菌株的优化。基于构建甲羟戊酸上游代谢途径pET28a-ES,将其酶切筛选后进行大肠杆菌为宿主菌的优化。首先对大肠杆菌宿主菌优化时选取了E.coli DH5α和E.coli BL21两种宿主菌进行比较优化,明确E.coli BL21对于甲羟戊酸代谢途径的适配性更好;然后发酵培养基选取了 LB培养基、M9培养基和X培养基三种培养基进行比较优化,经比较菌株在X培养基中发酵生长最佳。其中实验菌株BLES在X培养基中MVA的产量最高,达到1.25 g/L。最终选取BL21作为宿主菌并在X培养基中进行发酵。（2）构建角鲨烯的代谢途径。根据已优化的甲羟戊酸上游途径,构建下游途径来完善代谢通路,并对目标产物角鲨烯进行发酵检测产物。主要是以ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、fds为基础通过同尾酶的拼接连接到pET-22b的载体质粒上,形成基本的下游途径,即重组质粒pET22b-X。再添加来源于耶氏解脂酵母的ERG9,用于合成角鲨烯,即重组质粒pET22b-XQ。将 pET28a-ES 和 pET22b-XQ 共同转化到E.coli BL21 感受态中,得到角鲨烯工程菌株BLESXQ。发酵培养,对产物进行检测。测得产物角鲨烯,说明构建的角鲨烯代谢途径是可行的,且菌株BLESXQ在X培养基中产量明显达到最大值16.12 mg/L,同时进一步证明构建的甲羟戊酸的基本上下游途径在大肠杆菌中是可行的。（3）构建聚异戊二烯代谢途径。在上面构建pET22b-X的重组质粒的基础上添加来源于拟南芥的CPT和巴西橡胶树的SRPP,以形成目标代谢途径。得到两套聚异戊二烯代谢途径pET22b-XC重组质粒和pET22b-XS重组质粒。将两组重组质粒分别和pET28a-ES共同转化到E.coli BL21感受态中,得到聚异戊二烯工程菌株BLESXC和BLESXS,在菌株发酵验证产物,随后测CPT酶的酶活,没有检测到酶活和聚异戊二烯。说明CPT和SRPP基因所表达的酶并没有对聚异戊二烯的产生起到单独的作用。推测可能植物来源的酶与宿主不适配,可能缺少某种辅因子。

论文目录

• 学位论文数据集
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 甲羟戊酸
•     1.1.1 甲羟戊酸简介
•     1.1.2 甲羟戊酸的合成
•     1.1.3 甲羟戊酸途径
•     1.1.4 甲羟戊酸的检测
•   1.2 代谢工程与合成生物学
•     1.2.1 代谢工程简介
•     1.2.2 合成生物学简介
•     1.2.3 合成生物学的应用
•     1.2.4 合成生物学在代谢过程中的应用
•   1.3 类聚异戊二烯
•     1.3.1 角鲨烯
•       1.3.1.1 角鲨烯简介
•       1.3.1.2 角鲨烯的合成
•       1.3.1.3 角鲨烯的生物合成
•     1.3.2 聚异戊二烯
•       1.3.2.1 聚异戊二烯简介
•       1.3.2.2 聚异戊二烯的合成
•       1.3.2.3 聚异戊二烯的生物合成
•   1.4 本课题的研究思路和目的
•     1.4.1 研究目的
•     1.4.2 研究思路
• 第二章 甲羟戊酸菌株的优化
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料
•     2.2.1 实验菌株、质粒、引物
•     2.2.2 实验相关试剂、仪器
•     2.2.3 实验相关培养基
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 甲羟戊酸重组载体酶切验证
•     2.3.2 甲羟戊酸宿主菌的优化
•     2.3.3 甲羟戊酸培养基的优化
•     2.3.4 甲羟戊酸的检测
•   2.4 结果与讨论
•     2.4.1 甲羟戊酸重组载体验证结果
•     2.4.2 甲羟戊酸菌株的优化结果
•     2.4.3 甲羟戊酸的检测结果
•     2.4.4 甲羟戊酸的培养基优化结果
•   2.5 小结
• 第三章 角鲨烯工程菌的构建及产物检测
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料
•     3.2.1 实验菌株、质粒、引物
•     3.2.2 实验相关试剂、仪器
•     3.2.3 实验相关培养基
•   3.3 实验方法
•     3.3.1 下游重组质粒的构建
•       3.3.1.1 重组载体pET22b-X1的构建
•       3.3.1.2 重组载体pET22b-X2的构建
•       3.3.1.3 重组载体pET22b-X3的构建
•       3.3.1.4 重组载体pET22b-X4的构建
•       3.3.1.5 重组载体pET22b-X的构建
•       3.3.1.6 重组载体pET22b-XQ的构建
•       3.3.1.7 角鲨烯重组载体的酶切验证
•     3.3.2 角鲨烯基因工程菌株的构建
•     3.3.3 角鲨烯的检测
•   3.4 实验结果与讨论
•     3.4.1 重组载体构建及测序
•       3.4.1.1 重组载体pET22b-X1的构建及测序
•       3.4.1.2 重组载体pET22b-X2的构建及测序
•       3.4.1.3 重组载体pET22b-X3的构建及测序
•       3.4.1.4 重组载体pET22b-X4的构建及测序
•       3.4.1.5 重组载体pET22b-X的构建及测序
•       3.4.1.6 重组载体pET22b-XQ的构建及测序
•       3.4.1.7 角鲨烯重组载体验证结果
•     3.4.2 角鲨烯的检测结果
•   3.5 小结
• 第四章 聚异戊二烯工程菌的构建和产物检测
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料
•     4.2.1 实验菌株、质粒、引物
•     4.2.2 实验相关试剂、仪器
•     4.2.3 实验相关培养基
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 聚异戊二烯工程菌相关重组载体构建
•       4.3.1.1 重组载体pET22b-XC的构建
•       4.3.1.2 重组载体pET22b-XS的构建
•     4.3.2 聚异戊二烯重组载体酶切验证
•     4.3.3 聚异戊二烯基因工程菌的构建
•       4.3.3.1 聚异戊二烯工程菌株BLESXC的构建
•       4.3.3.2 聚异戊二烯工程菌株BLESXS的构建
•     4.3.4 聚异戊二烯的检测
•     4.3.5 异戊烯基转移酶（CPT）酶活的测定
•       4.3.5.1 重组载体pET22b-C的构建及其蛋白检测
•       4.3.5.2 重组载体pET22b-T7C的构建及其蛋白检测
•       4.3.5.3 重组载体pET22b-T7βC的构建及其蛋白检测
•       4.3.5.4 异戊烯基转移酶体外反应
•   4.4 实验结果
•     4.4.1 聚异戊二烯工程菌相关载体构建结果
•       4.4.1.1 重组载体pET22b-XC的构建及测序
•       4.4.1.2 重组载体pET22b-XS的构建及测序
•       4.4.1.3 重组载体酶切验证结果
•     4.4.2 聚异戊二烯产物的检测结果
•       4.4.2.1 聚异戊二烯工程菌BLESXC的检测结果
•       4.4.2.2 聚异戊二烯工程菌BLESXS的检测结果
•     4.4.3 异戊烯基转移酶（CPT）酶活的测定结果
•       4.4.3.1 重组载体pET22b-C的构建及其蛋白检测结果
•       4.4.3.2 重组载体pET22b-T7C的构建及其蛋白检测结果
•       4.4.3.3 重组载体pET22b-T7βC的构建及其蛋白检测结果
•       4.4.3.4 异戊烯基转移酶体外反应结果
•   4.5 小结
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•   5.2 问题与展望
• 参考文献
• 附录一 本实验所用生物及化学试剂
• 附录二 本实验所用设备仪器
• 致谢
• 作者及导师简介
• 附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王丽娟

导师: 王峥,余军阳

关键词: 甲羟戊酸途径,甲羟戊酸,角鲨烯,聚异戊二烯,代谢工程,合成生物

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京化工大学

分类号: Q78

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.000819

总页数: 95

文件大小: 8063K

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