Mycobacterium smegmatis酰基转移酶的表面修饰及其突变体的酶学常数分析

论文摘要

酶分子的表面修饰技术是指利用蛋白质工程技术对酶分子表面的某些氨基酸残基进行置换;或在酶分子表面的特定位置偶联某些化学基团。通过对酶分子表面进行修饰,提高酶分子在特定溶剂中的稳定性或催化活性;调控酶分子在特定溶剂中的聚集行为;提高酶分子固定化效果等。表面修饰技术已越来越广泛地应用于酶分子的改造中。本论文以具有多功能催化活性（Promiscuous activity）的Mycobacterium smegmatis酰基转移酶（Acyl transferase,缩写为MsAcTase）为研究对象,利用定点突变技术,首先在MsAcTase分子表面不同位置引入突变氨基酸残基;然后借助突变氨基酸残基,对突变后的MsAcTase进行糖基化修饰。为实现这一目的,体内糖基化修饰和体外糖基化修饰两条技术路线,将被尝试。MsAcTase突变体编码基因分别导入毕赤酵母和大肠杆菌中异源表达。选择毕赤酵母表达外源突变基因,以期利用毕赤酵母本身的糖基化修饰系统,对重组蛋白进行胞内糖基化修饰;而选择大肠杆菌表达外源突变基因,重组蛋白将进行体外糖基化修饰。具体实验结果如下:1、利用YASARA软件,结合已解析的MsAcTase八聚体结构,在MsAcTase分子的表面,筛选合适的突变位点。拟进行体内糖基化修饰的突变基因,筛选并构建具有Asn-Xaa-Ser/Thr序列的突变体;拟进行体外糖基化修饰的突变基因,在MsAcTase分子表面的合适位点引入-Cys突变。经过分析,最终筛选出MsAcTase-Q159N,MsAcTase-I186N,MsAcTase-D203S三个候选突变体作为体内糖基化修饰的突变体;筛选出MsAcTase-C7S/C77S/A143C和MsAcTase-C7S/C77S/S184C,作为体外糖基化修饰的候选突变体。2、评估上述突变体的突变效应。将上述突变基因分别导入到大肠杆菌中,诱导表达,并分离纯化后,测定突变体重组蛋白的基本酶学性质,评估突变效应。实验结果表明:MsAcTase-I186N的比活力降低为野生型MsAcTase的74%,而突变体MsAcTase-D203S和突变体MsAcTase-Q159N的酶比活并没有显著变化;以乙酸乙酯为底物测定MsAcTase、MsAcTase-Q159N和MsAcTase-D203S的kcat/Km分别为:219.9L·mmol-1·min-1,147.3 L·mmol-1·min-1,163.0L·mmol-1·min-1。MsAcTase-C7S/C77S/A143C和MsAcTase-C7S/C77S/S184C的比活力与野生型MsAcTase相比均降低,突变体MsAcTase-C7S/C77S/A143C比活力降低为野生型MsAcTase的70%,突变体MsAcTase-C7S/C77S/S184C的比活力降低为野生型MsAcTase的55%。以乙酸乙酯为底物测定的MsAcTase、MsAcTase-C7S/C77S/A143C、MsAcTase-C7S/C77S/S184C的kcat/Km分别为:219.9 L·mmol-1·min-1,144.6 L·mmol-1·min-1,124.3 L·mmol-1·min-1。显著性分析表明:除突变体MsAcTase-I186N、MsAcTase-C7S/C77S/A143C和MsAcTase-C7S/C77S/S184C外,MsAcTase-Q159N和MsAcTase-D203S均无显著性差异。3、将野生型过水解酶MsAcTase及其突变体MsAcTase-Q159N和MsAcTase-D203S的编码基因导入到毕赤酵母中表达,分离纯化后测定的重组蛋白比活力分别为:MsAcTase、MsAcTase-Q159N和MsAcTase-D203S的比活力分别是47.6 U/mg,56.4U/mg和47.9 U/mg。以乙酸乙酯为底物,MsAcTase、MsAcTase-Q159N和MsAcTase-D203S的kcat/Km分别为:47.0 L·mmol-1·min-1,65.6 L·mmol-1·min-1,61.5L·mmol-1·min-1。PAS染色和Endo H糖苷酶处理重组MsAcTase和突变体重组蛋白,实验结果均表明:实验结果均未发现两个突变体被糖基化修饰。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 绪论
•   1 酶蛋白分子的表面修饰及其对酶学性质的影响
•     1.1 定点突变引入特定氨基酸残基
•     1.2 PEG共价修饰
•     1.3 糖基化修饰
•       1.3.1 蛋白质糖基化修饰的类型
•       1.3.2 糖基化修饰对蛋白质的影响
•       1.3.3 对蛋白质进行糖基化修饰的策略
•       1.3.4 糖蛋白的表征方法
•   2 分子表面修饰技术在酶蛋白固定化中的应用
•   3 酰基转移酶
•     3.1 酰基转移酶简介
•     3.2 酰基转移酶的多功能催化活性
•     3.3 酰基转移酶过水解催化活性的应用
•   4 论文研究意义及主要研究内容
•     4.1 研究意义
•     4.2 主要研究内容
•     4.3 技术路线
• 第一章 体内糖基化修饰MsAcTase突变体蛋白突变效应的评估与突变体的筛选
•   1 前言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 菌株与质粒
•       2.1.2 实验试剂
•       2.1.3 实验仪器以及设备
•       2.1.4 培养基及各种缓冲液
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 结构模拟分析
•       2.2.2 突变体大肠杆菌表达体系的构建
•       2.2.3 重组MsAcTase在 E.coli BL21（DE3）的表达
•       2.2.4 粗酶纯化及SDS-PAGE分析
•       2.2.5 重组MsAcTase酶活测定
•       2.2.6 MsAcTase蛋白含量的测定
•       2.2.7 重组MsAcTase酶学常数的测定
•   3 结果与讨论
•     3.1 MsAcTase N-糖基化候选位点分析
•     3.2 MsAcTase N-糖基化候选位点的筛选
•     3.3 重组MsAcTase表达载体的构建
•     3.4 重组MsAcTase的表达与纯化
•     3.5 大肠杆菌表达突变体酶蛋白的酶活分析
•     3.6 重组MsAcTase及其突变体酶蛋白的酶学常数测定
•   4 小结
• 第二章 MsAcTase及体内糖基化修饰MsAcTase突变体编码基因在Pichiapastoris GS115中的异源表达及其酶学性质表征
•   1 前言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 菌株与质粒
•       2.1.2 实验试剂
•       2.1.3 仪器
•       2.1.4 各种培养基及实验试剂的配制
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 SDS碱裂解法小量制备质粒pET28a-MsAcTase
•       2.2.2 用氯化钙制备大肠杆菌E.coli BL21（ DE3）感受态
•       2.2.3 MsAcTase基因的扩增与纯化
•       2.2.4 PCR扩增产物的回收
•       2.2.5 重组表达质粒的构建
•       2.2.6 连接产物转化E.coli BL21（DE3）
•       2.2.7 重组表达载体p PIC9K-MsAcTase的验证
•       2.2.8 引入的N-糖基化位点突变
•       2.2.9 目的基因在毕赤酵母中表达
•       2.2.10 MsAcTase及其突变体基因在毕赤酵母中的诱导表达
•       2.2.11 重组MsAcTase及其突变体酶蛋白的分离纯化
•       2.2.12 重组MsAcTase及其突变体酶活力及蛋白浓度的测定
•       2.2.13 重组MsAcTase及其突变体酶动力学常数的测定
•       2.2.14 重组MsAcTase及其突变体酶蛋白的糖基化修饰表征
•   3 结果与讨论
•     3.1 MsAcTase基因的扩增
•     3.2 突变体的构建
•     3.3 毕赤酵母阳性转化子的筛选
•     3.4 MsAcTase在毕赤酵母中的表达与纯化
•     3.5 毕赤酵母表达的MsAcTase酶活性分析
•     3.6 毕赤酵母表达的MsAcTase动力学常数分析
•     3.7 突变体酶蛋白的体内糖基化修饰鉴定
•   4 小结
• 第三章 MsAcTase及体外糖基化修饰MsAcTase突变体的酶学性质分析
•   1 前言
•   2 材料与方法
•     2.1 实验材料
•       2.1.1 菌株与材料
•       2.1.2 实验试剂
•       2.1.3 仪器
•       2.1.4 各种培养基及实验试剂的配制
•     2.2 实验方法
•       2.2.1 结构模拟分析
•       2.2.2 叠加突变体的构建
•       2.2.3 MsAcTase和三个突变体粗酶液的制备
•       2.2.4 MsAcTase和三个突变体酶蛋白的镍柱亲和层析
•       2.2.5 MsAcTase和三个突变体酶蛋白的SDS-PAGE分析
•       2.2.6 MsAcTase和三个突变体酶蛋白酶活力及蛋白浓度的测定
•       2.2.7 MsAcTase和三个突变体酶蛋白酶学常数的测定
•   3 结果与讨论
•     3.1 MsAcTase体外糖基化修饰位点的筛选
•     3.2 MsAcTase体外糖基化修饰突变体的构建
•     3.3 叠加突变体的测序结果分析
•     3.4 MsAcTase和三个突变体酶蛋白的SDS-PAGE分析
•     3.5 MsAcTase和三个突变体酶蛋白的酶活分析
•     3.6 MsAcTase和三个突变体酶蛋白的动力学常数测定
•   4 小结
• 第四章 总结与后续工作
•   4.1 总结
•   4.2 后续工作
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 牛晶红

导师: 舒正玉

关键词: 酰基转移酶,蛋白质表面修饰,定点突变,异源表达,糖基化修饰

来源: 福建师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 福建师范大学

分类号: Q55

DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000230

总页数: 93

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