重组腺病毒表达抗癌肽ANP对舌鳞状细胞癌抑癌作用的研究

论文摘要

抗癌肽是一类小分子多肽类新型抗癌药物,通过破坏肿瘤细胞膜结构、抑制癌细胞增殖和迁移以及肿瘤血管的形成等达到对癌细胞杀伤作用,而对正常细胞的毒性较低,是目前抗肿瘤新药研究的一大热点。研究发现心房利钠肽ANP（Atrial natriuretic peptide）来源的心房肽类激素可以强力抑制癌细胞DNA的合成,从而抑制癌细胞的生长,而对正常的人体细胞无损伤;它还可以缓解抗癌药物对肾脏、肝脏的毒性作用。在癌组织细胞表达ANP既可以解决多肽类药物半衰期短的问题,也可以避免对其他细胞的副作用。采用基因治疗的策略,用重组腺病毒感染哺乳动物细胞分泌表达抗癌肽ANP,使ANP与癌细胞“亲密接触”,克服抗癌药物不易到达靶点的缺点,同时可以在癌症组织细胞持续表达抗癌肽ANP,达到高效杀灭癌细胞的目的。本研究根据ANP的cDNA序列设计特异性引物,通过提取细胞内RNA,逆转录得到cDNA,PCR得到ANP基因。设计携带Igκ信号肽的重叠PCR引物,重叠PCR获得Igκ信号肽基因,将ANP基因和Igκ信号肽基因通过重叠PCR获得IgANP基因。将ANP与IgANP基因连接T载体经测序鉴定正确后,分别将ANP基因和IgANP基因连接到pAd-Track-CMV穿梭载体上,最后将线性化pAd-Track-ANP与腺病毒骨架载体pAd-easy共同转化BJ5183大肠杆菌进行同源重组,获得pAd-ANP和pAd-IgANP重组腺病毒载体。将重组腺病毒载体转染293A细胞包装获得腺病毒,通过PCR的方法鉴定该病毒基因组含有ANP基因。用F1代腺病毒不断扩增到F5代,测定F5代重组腺病毒的滴度为108PFU/ml,Ad-EGFP、Ad-ANP和Ad-IgANP的VP值分别为8.5×1011、5.4×1011和6.1×1011,重组腺病毒可以用于后续细胞测试。用流式细胞仪检测转染效率,确定表达ANP重组腺病毒对舌癌细胞最佳感染复（MOI）为100。重组腺病毒感染SCC9细胞,从细胞中提取RNA,逆转录鉴定ANP基因有表达。免疫荧光实验检测到ANP在舌癌细胞内有明显表达,MTT实验检测细胞活力表明重组腺病毒Ad-ANP感染SCC9细胞在48h、72h和96h时细胞相对存活率分别为79.9%、82.0%和82.9%;对SCC25细胞相对存活率分别为97.1%,94.0%和79.5%。重组腺病毒Ad-IgANP感染SCC9细胞在48h、72h和96h时细胞相对存活率分别为89.9%,93.8%和90.2%;对SCC25细胞相对存活率分别为98.9%,91.9%和85.9%。克隆形成实验检测结果表明,重组腺病毒Ad-ANP表达抗癌肽ANP对SCC9细胞和SCC25细胞克隆形成的抑制率分别为36.9%和62.9%;重组腺病毒Ad-IgANP表达ANP抑制率分别为22.3%和34.6%。划痕实验检测结果表明Ad-ANP在72h时对SCC9细胞迁移速率降低67.8%;对SCC25细胞48和72h迁移速率率分别降低47.9%和37.6%。Ad-IgANP在48h时对SCC9迁移速率无影响,在24h和72h迁移率分别降低40.9%和58.7%;对SCC25细胞在24h迁移速率无影响,在48h和72h细胞迁移速率分别降低46.9%和34.2%。流式细胞仪检测细胞周期结果表明Ad-EGFP处理SCC9细胞Go/G1期、S期和G2/M细胞分别占59.7%、19.6%和17.7%,SCC25细胞分别占59.1%、25.0%和15.8%;重组腺病毒Ad-ANP处理SCC9细胞Go/G1期、S期和G2/M细胞分别占67.0%、11.9%和17.7%,SCC25细胞分别占62.1%、23.2%和14.7%;重组腺病毒Ad-IgANP处理SCC9细胞Go/G1期、S期和G2/M细胞分别占57.6%、18.1%和19.3%,SCC25细胞分别占60.9%、29.8%和9.3%。Ad-ANP和Ad-IgANP对SCC9和SCC25细胞周期均无显著影响。Ad-ANP对SCC9细胞凋亡增加了65.9%,对SCC25细胞凋亡率增加57.9%;重组腺病毒Ad-IgANP表达抗癌肽ANP对SCC9细胞凋亡增加了61.6%,对SCC25细胞凋亡率增加8.7%。Western blot检测重组腺病毒感染细胞后蛋白表达,结果表明,Ad-ANP和Ad-IgANP均上调SCC9细胞和SCC25细胞PARP、caspase8和BAX蛋白的表达,而caspase3的表达无明显变化;确定重组腺病毒Ad-ANP和Ad-IgANP在细胞内表达ANP可能是通过caspase8信号通路增加舌磷状细胞癌细胞SCC9和SCC25的凋亡。本研究通过重组腺病毒表达抗癌肽ANP,发现重组表达ANP对舌癌细胞SCC9和SCC25的增殖和凋亡有明显的的影响,明确ANP对舌癌细胞生长抑制的可能机制是通过引起细胞线粒体途径的细胞凋亡导致,同时也提示利用基因治疗的策略通过腺病毒重组表达抗癌肽ANP在舌癌治疗中具有一定的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
•   1.1 抗癌肽的概述
•   1.2 ANP的简介
•     1.2.1 ANP的来源
•     1.2.2 ANP的作用机理
•   1.3 腺病毒的简介
•   1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 重组腺病毒载体的构建和重组腺病毒的包装
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 实验细胞、菌株
•     2.1.2 质粒
•     2.1.3 实验试剂及耗材
•     2.1.4 实验仪器设备
•     2.1.5 培养基及各试剂配方
•     2.1.6 相关缓冲液和其它试剂配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 ANP和 Ig ANP基因的获得
•     2.2.2 ANP和 Ig ANP基因穿梭载体的构建
•     2.2.3 BJ5183 同源重组构建重组腺病毒载体pAdEasy-ANP
•     2.2.4 重组腺病毒载体转染293A细胞获得重组腺病毒
•     2.2.5 重组腺病毒的质量控制
•   2.3 实验结果
•     2.3.1 ANP基因的PCR扩增
•     2.3.2 重叠PCR获取IgANP基因
•     2.3.3 克隆载体的提取
•     2.3.4 克隆载体双酶切鉴定
•     2.3.5 克隆载体和腺病毒穿梭空载体双酶切回收
•     2.3.6 腺病毒穿梭载体的提取
•     2.3.7 腺病毒穿梭载体载体双酶切鉴定
•     2.3.8 腺病毒穿梭载体的单酶切线性化及回收
•     2.3.9 腺病毒表达载体的提取
•     2.3.10 腺病毒表达载体单酶切鉴定
•     2.3.11 腺病毒表达载体转DH5α提质粒
•     2.3.12 腺病毒表达载体转DH5α质粒酶切鉴定
•     2.3.13 重组腺病毒的的包装
•     2.3.14 重组腺病毒的PCR鉴定
•     2.3.15 重组腺病毒的质量控制
•   2.4 小结
• 第三章 重组腺病毒表达抗癌肽ANP对舌癌细胞的作用效果
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 实验细胞
•     3.1.2 主要实验试剂
•     3.1.3 培养基及各试剂配方
•     3.1.4 主要实验仪器
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 感染复数的确定
•     3.2.2 RT-PCR检测重组腺病毒在舌癌细胞中表达检测
•     3.2.3 免疫荧光实验鉴定重组腺病毒在舌癌细胞中的表达
•     3.2.4 MTT细胞相对活性检测
•     3.2.5细胞克隆形成实验
•     3.2.6 细胞划痕实验测定细胞迁移率
•     3.2.7 流式细胞仪检测周期
•     3.2.8 流式细胞仪检测凋亡
•     3.2.9 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达
•     3.2.10 统计学分析
•   3.3 实验结果
•     3.3.1 感染复数的确定
•     3.3.2 RT-PCR检测ANP的表达
•     3.3.3 免疫荧光鉴定ANP的表达
•     3.3.4 MTT检测细胞相对活性
•     3.3.5克隆形成实验
•     3.3.6 细胞划痕实验测定细胞迁移率
•     3.3.7 流式细胞仪检测周期
•     3.3.8 流式检测细胞凋亡
•     3.3.9 Western Blot检测凋亡相关蛋白表达情况
•   3.4 小结
• 第四章 结论与讨论
•   4.1 重组腺病毒载体的构建和重组腺病毒的包装
•   4.2 重组腺病毒表达抗癌肽ANP对舌癌细胞的抑制效果
• 参考文献
• 致谢
• 附录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 岳硕豪

导师: 张军林,王伟平

关键词: 心房利钠肽,舌鳞状细胞癌,重组腺病毒,基因治疗

来源: 湖北工业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物学,药学

单位: 湖北工业大学

基金: 武汉生物工程学院科技创新培育基金

分类号: Q78;R979.1

总页数: 68

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