导读:本文包含了光滑球拟酵母论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:酵母,光滑,转录,因子,麦角固醇,丙酮酸,核苷酸。
光滑球拟酵母论文文献综述
罗正山[1]（2019）在《光滑球拟酵母积累丙酮酸关键生理调控机制解析》一文中研究指出丙酮酸(pyruvic acid)是细胞代谢的关键中间产物,也是一种重要的有机酸,被广泛应用于食品工业、农业、医药工业等领域。近年来,发酵法生产丙酮酸受到国内外学者的密切关注。在众多已发现的丙酮酸生产菌株中,光滑球拟酵母(Candida glabrata)因具有高葡萄糖和酸耐受性,被认为是最具应用前景的丙酮酸生产菌株。然而,该菌株的丙酮酸发酵过程存在副产物形成机制不明确、胞内中心化合物调控复杂和溶氧依赖性强等问题影响了其大规模生产。本研究以C.glabrata CCTCC M202019为出发菌株,借助于生化工程和代谢工程策略,鉴定该酵母丙酮酸发酵过程中的主要副产物及其合成途径,并在此基础上提出代谢工程改造C.glabrata中心代谢网络的策略来强化丙酮酸合成及改善菌株对低氧环境的适应性。主要研究结果如下:(1)高通量筛选丙酮酸发酵过程差异明显的C.glabrata突变菌株为副产物鉴定提供基础。结合ARTP随机诱变和硝酸铁多孔板检测技术建立了一种高通量筛选丙酮酸发酵过程差异明显突变菌株的方法。进一步结合QPix 420全自动挑菌仪和全自动移液工作站等自动化仪器,提高了该方法的筛选通量和精度,使得整个高通量筛选过程更加高效。利用该方法从30000个突变子中经过几轮的高通量筛选,初筛获得了9株高产丙酮酸的突变菌株。通过摇瓶发酵复筛实验,最终获得了一株丙酮酸摇瓶产量提高32.3%的C.glabrata H6菌株和一株能使发酵液自发凝固的丙酮酸生产菌株C.glabrata 4-C10。这些丙酮酸发酵过程差异明显的突变菌株的获得为进一步鉴定C.glabrata丙酮酸发酵过程中的副产物提供基础。(2)鉴定C.glabrata发酵生产丙酮酸过程中的主要副产物及其代谢途径。通过对获得的C.glabrata 4-C10突变菌株和出发菌株的发酵液进行分离纯化,并结合酸水解、光谱分析及合成单体组分分析实验,鉴定了C.glabrata发酵生产丙酮酸过程中的主要副产物为多聚糖。对C.glabrata的副产物合成途径中相关基因进行转录水平分析,发现CAGL0H02695g和CAGL0K10626g基因是造成菌株胞外多聚糖积累的重要基因。在C.glabrata出发菌株中敲除这两个重要基因,使得菌株的副产物多聚糖积累降低了15.6%,而丙酮酸摇瓶产量提高了11.8%。实验结果也表明,虽然降低多聚糖合成会一定程度的改善丙酮酸胞外积累,但也会严重影响菌体生长。因此,完全阻断多聚糖合成来改善丙酮酸积累的策略似乎不可行。而调控与多聚糖合成密切相关的中心化合物来协调菌株生长与多聚糖合成似乎是进一步改善丙酮酸积累的高效策略。(3)调控C.glabrata发酵过程中丙酮酸亚细胞分布来强化丙酮酸的胞外积累。已有大量报道表明副产物多聚糖积累与胞内丙酮酸和ATP的亚细胞分布密切相关。借助载体工程策略研究丙酮酸的亚细胞分布对C.glabrata的中心碳代谢途径和丙酮酸胞外积累的影响,找到有利于丙酮酸胞外积累的最佳丙酮酸胞内分布趋势。强化丙酮酸进入线粒体的过程,改善了C.glabrata的中心碳代谢途径和丙酮酸胞外积累速率。在此过程中,发现和验证了不断积累的胞质丙酮酸趋势是影响C.glabrata中心碳代谢和丙酮酸胞外积累的关键因素。通过细胞膜定位表达线粒体丙酮酸载体蛋白调控丙酮酸向胞外转运,使C.glabrata中胞质丙酮酸分布趋势由上升趋势转变为下降趋势,达到了改善C.glabrata菌株的中心碳代谢途径和丙酮酸积累的目的,使得丙酮酸的积累量达到29.0g/L。同时,构建了一种结合sortase A介导连接和流式细胞检测技术的快速膜定位检测方法。(4)构建高效ATP无效循环系统缓解ATP对丙酮酸合成途径的反馈抑制。已有报道表明高胞内ATP水平不仅有利于菌株高效合成多聚糖等副产物,而且还会对糖酵解途径产生严重的反馈抑制,进而影响目标产物的合成。利用代谢工程策略构建了一种能高效降解C.glabrata胞内ATP的无效循环系统(ATP-FCS),并进一步优化了该系统与中心代谢途径的关系改善了C.glabrata菌株的丙酮酸积累过程。通过对C.glabrata菌株生理特性的分析,将两种酶促反应过程(丙酮酸羧化酶(PYC2p)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1p))引入C.glabrata的细胞质中,结合菌株本身的部分代谢途径构建ATP无效循环系统。对该系统进行评估,发现ATP-FCS能高效维持C.glabrata丙酮酸发酵过程中的胞内ATP和ROS处于较低水平,并有效改善了中心碳代谢流流向丙酮酸的效率,使得丙酮酸的胞外积累量提高了49.7%。另外,进一步优化ATP-FCS并协调ATP-FCS与其他代谢途径的关系,使得C.glabrata丙酮酸的最大摇瓶产量达到40.2 g/L。(5)设计低氧全局诱导因子缓解C.glabrata丙酮酸发酵过程对高溶氧的依赖性。高的胞外溶氧会加速菌株胞内丙酮酸进入TCA循环和氧化磷酸化途径,导致大量丙酮酸氧化分解成CO_2,同时产生大量ATP。借助于代谢工程策略研究了低氧诱导因子(HIF-1)在低氧条件下对C.glabrata丙酮酸发酵过程的影响,改善C.glabrata低氧条件下的丙酮酸积累过程。通过文献挖掘和数据库分析手段,发现C.glabrata葡萄糖转运和糖酵解途径中的大部分酶基因启动子区域存在HIF-1因子特异性识别的A/GCGTC基序。通过引入HIF-1因子于C.glabrata中,改善了菌株在低氧条件下的葡萄糖转运和糖酵解途径中一些关键酶基因的转录水平,并使低氧条件下的丙酮酸产量提高了32.4%。进一步优化菌株的溶氧控制条件、敲除C.glabrata中的脯氨酸羟基化酶来改善HIF-1在菌株胞内的稳定性,使得丙酮酸在低氧条件下的积累效率得到了进一步提高。最后,维持菌株在发酵罐上的溶氧水平为10%,使得菌株的最大丙酮酸产量达53.1 g/L。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
吴承晋[2]（2019）在《光滑球拟酵母转录因子CgRds2应答环境胁迫的生理机制》一文中研究指出微生物在自然生长和发酵生产过程中经常会面临胁迫环境,抑制菌体生长并且降低发酵产物的产量。通过调节转录因子的表达来抵御环境胁迫已经成为一种有效的策略。本论文以一株光滑球拟酵母Candida glabrata ATCC 55为研究对象,以解析光滑球拟酵母抵御盐胁迫和酸胁迫的生理机制为研究目的,利用分子生物学和生物化学等分析方法,就转录因子CgRds2应答盐胁迫和酸胁迫的生理机制展开研究,主要结果如下:1.采用基因敲除和回补表达的方法构建了敲除菌株Cgrds2Δ和回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2,发现:在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了23.4%和39.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度和细胞存活率分别提高了10.2%和6.3%;在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了32.6%和56.9%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度没有显着变化,但细胞存活率提高了17.6%。2.通过转录组数据分析发现,盐胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中糖酵解、核糖体生物合成和rRNA转录等路径中基因的转录水平显着上调;脂质代谢、MAPK信号传导和细胞周期等路径中基因的转录水平显着下调,其中脂质代谢路径中甘油磷脂代谢基因的表达量变化最为显着。进一步研究盐胁迫下CgRds2的调控机制发现,MAPK路径中的关键激酶CgHog1能够与转录因子CgRds2发生相互作用,并且CgHog1通过磷酸化CgRds2的Ser64和Thr97两个位点激活转录因子CgRds2。最后,CgHog1介导CgRds2调节甘油磷脂基因的表达、甘油磷脂组分和细胞膜完整性。在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中甘油磷脂基因的转录水平显著降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了30.3%和47.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中总磷脂含量和细胞膜完整性分别提高了27.2%和12.1%;磷酸化位点突变菌株Cgrds2~(2A)中Cg Rds2与甘油磷脂基因的结合程度显着降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了29.4%和21.8%。3.通过转录组数据分析发现,酸胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中减数分裂、蛋白质转运和转录过程等路径中基因的转录水平显著上调;翻译过程、细胞膜生物合成、氨基酸代谢和能量代谢等路径中基因的转录水平显着下调。进一步研究酸胁迫下CgRds2的调控机制发现,钙离子响应路径中的钙调磷酸激酶CgCmk1能够与转录因子CgRds2的PAS结构域发生相互作用,激活转录因子CgRds2的表达,使其从细胞质转移到细胞核中发挥作用。最后,CgCmk1介导CgRds2调节能量代谢基因的表达、胞内ATP含量和细胞膜通透性。在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中能量代谢基因的转录水平显著降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了33.5%和23.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中胞内ATP含量和细胞膜通透性分别提高了41.5%和18.8%;PAS结构域缺失菌株Cgrds2-pas中CgRds2与能量代谢基因的结合程度显着降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了30.7%和19.1%。(本文来源于《江南大学》期刊2019-06-01）
吴静,唐蕾,刘立明[3]（2017）在《光滑球拟酵母转录因子Asg1p调控鲁棒性的生理机制》一文中研究指出为了阐明缺失转录因子CgAsg1p对光滑球拟酵母鲁棒性的影响,通过同源重组的方法构建突变菌株Cgasg1△,比较基因缺失突变株在不同条件下的细胞生长、基因转录水平和对不同胁迫的抵御能力。结果表明:与野生型菌株wt相比,突变菌株Cgasg1△失去在pH 2.0下的生长能力,转录因子CgAsg1p在低p H条件下通过改变一系列应答基因的转录水平,影响压力调控、氧化还原过程、跨膜转运、DNA复制、重组和修复等生物过程,此外,突变菌株Cgasg1△也失去了对氧化胁迫和高渗胁迫的抵御能力。因此,CgAsg1p是光滑球拟酵母抵御多种胁迫的关键转录因子。(本文来源于《食品与生物技术学报》期刊2017年02期）
徐楠[4]（2016）在《光滑球拟酵母基因组规模生物模型的构建与应用》一文中研究指出本文以丙酮酸工业生产菌株Candida glabrata CCTCC M202019为研究模型,在完成全基因组测序、基因组功能注释和比较基因组学研究的基础上,构建了基因组规模代谢网络模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、转录调控网络模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工业微生物辅因子代谢网络模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。结合上述基因组规模生物模型,运用基于约束的优化算法,从基因、代谢、转录、辅因子等层面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高产、低致病性相关的生物安全性等),并发展了优化其生产性能(如丙酮酸、富马酸等丙酮酸去路中代谢物)的方法。主要研究结果如下:1.运用二代高通量测序技术,对C.glabrata CCTCC M202019进行全基因组测序,其基因组特征包括:12.1 Mbp基因组大小、38.47%GC含量、5345个基因、191个t RNA、6个r RNA和1.15%的重复序列等。与C.glabrata CBS138进行比较基因组分析,发现虽然两菌基因组具有高度相似性,但也存在差异如:中心碳代谢(营养物质和二羧酸的转运、氧化磷酸化和丙酮酸分解代谢)和黏附性代谢(凝集素蛋白的低复杂度重复区和功能结构域的缺失和变化)。在此基础上,借助在四种培养基上的丙酮酸发酵实验、哥伦比亚血平板上生长实验、96孔微孔板内壁和内皮细胞的黏附实验,证明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更强的丙酮酸生产能力和更弱的黏附性和细胞毒性。2.根据C.glabrata氨基酸序列、文献挖掘和专业数据库,构建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804个基因、1025个代谢物和1287个生化反应,分布于细胞质、线粒体、过氧化物酶体、高尔基体、液泡和胞外区间。利用模型i NX804解析C.glabrata生理特征,发现C.glabrata具有较窄的碳源底物谱和宽泛的氮源底物谱;在全合成培养基和类血清培养基上的必需基因分别是130个和74个;高效积累丙酮酸的原因是其具有高效的葡萄糖转运系统、3条丙酮酸生物合成途径(糖酵解、磷酸戊糖途径和丙酮醛降解),以及丙酮酸分解代谢的弱化。进一步对其生产性能进行优化,包括:(1)双基因敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶、双基因敲除D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶,均能够促进丙酮酸积累;(2)抑制α-酮戊二酸脱氢酶、增加硫胺素含量和线粒体中ATP水平,可提高α-酮戊二酸的产量;(3)富马酸产量会随着糖酵解途径和胞质还原路径的流量而递增;(4)异源表达α-乙酰乳酸脱羧酶,有利于增加乙偶姻的产量。基于GSMM i NX804的改造策略已成功验证或预测了相关产品的积累如富马酸和乙偶姻等。3.利用C.glabrata转录组数据,整合从头反向工程(De-novo reverse-engineering)和同源比对的方法,构建了C.glabrata基因组规模转录调控网络,包括145个转录因子和3239个靶基因间6655种相互作用。该网络具有典型的TRN的拓扑结构特征,并且在子网络功能上具有显着的网络内聚性。结合C.glabrata的GSMM i NX804,从C.glabrata致病性转录调控模块中筛选得到,6种必需代谢物及其相关的8种酶可作为药物靶点,并且已经在C.glabrata或其他微生物中得到验证。4.基于14种工业微生物的GSMMs,通过基因功能再注释、模型标准化和精细化、模型代谢漏洞填补,构建了工业微生物的GSCMM icm NX6434,包括:6434个基因、1782个代谢物和6877个反应。GSCMM icm NX6434展示了辅因子参与的代谢反应的酶学、细胞分区等基本特征,原核和真核微生物的辅因子代谢占基因组的比率分别为12.9%和4.8%,两者共有的533个反应分布在63条代谢途径中,已验证的两者特有的辅因子代谢分别包括,34条代谢途径中的152个反应和20条代谢途径中的77个反应。ATP、NADH、NADPH和乙酰Co A的合成主要来源于12、21、18和15个反应,可通过30、7、21和29个反应进行消耗,消耗的辅因子主要参与生物大分子的合成或实现不同代谢途径间的关联。不同辅因子之间的相互转化,包括ATP-NAD、ATP-乙酰Co A、ATP-NADP(H)、Co A-NADH、Co A-NADPH和NAD-NADP,可作为全局性调控胞内辅因子水平和形式的作用靶点。5.基于工业微生物的GSCMM icm NX6434,解析辅因子对细胞生长、产物合成和细胞鲁棒性的影响:(1)微生物生长所必需的辅因子代谢,包含2480个基因和2948个生化反应。促进细胞生长的36个辅因子靶点中21个已得到验证,主要通过增加ATP、NAD、NADPH和乙酰Co A的合成,促使辅因子用于必需代谢模块,避免副产物形成和无效循环,从而促进细胞生长。(2)根据25种工业产品对辅因子的需求分析,发现辅因子通过影响酶活性、底物水平、酶活和底物水平、与其他辅因子对相互作用等四种方式影响目标产物的合成。通过调控辅因子的浓度、形式、平衡性影响碳代谢流的流量和流向,从而促进目标产物的合成。(3)整合胁迫条件下28组转录组学数据,发现在酸性、氧化、高温、高渗胁迫条件下,微生物细胞内ATP、NAD(H)、NADP(H)、乙酰Co A分别发生显着变化。而调控碳代谢流促进相应的辅因子合成,或促使辅因子用于胁迫响应途径,则可增强工业微生物的鲁棒性。(本文来源于《江南大学》期刊2016-12-01）
闫冬妮[5]（2016）在《转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母应答酸胁迫的生理机制》一文中研究指出本论文以一株光滑球拟酵母(Candida glabrata)的叁重缺陷型(组氨酸、色氨酸和尿嘧啶)C.glabrata ATCC 55为研究对象。以解析光滑球拟酵母的酸胁迫调控机制为目的,运用分子生物学、转录组学、和气质联用等方法,通过比较基因Cg CRZ1缺失前后细胞生长、基因转录水平、细胞膜成分和细胞膜结构性能,就转录因子Cg Crz1p在光滑球拟酵母应答酸胁迫的作用机制展开研究。主要研究结果如下:1.采用基因敲除和回补方法构建了缺失基因Cg CRZ1、Cg RLM1、Cg HAL6、Cg USV1、Cg RDS2、Cg CST6和Cg RTG1的突变菌株Cgcrz1Δ、Cgrlm1Δ、Cghal6Δ、Cgusv1Δ、Cgrds2Δ、Cgcst6Δ、Cgrtg1Δ及回补菌株Cgcrz1Δ/Cg CRZ1;发现:在p H2.0时,突变菌株Cgcrz1Δ的生物量降低了60%,细胞活性在培养12 h后降低了50%;在p H6.0时,回补菌株Cgcrz1Δ/Cg CRZ1的生物量提高了1倍,在p H2.0时生物量提高了1.25倍,细胞活性提高了7倍。2.运用转录组学分析突变菌株Cgcrz1Δ酸耐受性降低的原因,发现:涉及细胞膜脂质合成与代谢的许多基因转录水平存在差异,参与脂肪酸链的合成与延伸过程的基因转录水平下调,脂肪酸合成可能被抑制,脂肪麦角甾醇合成途径的基因转录水平上调,麦角甾醇合成可能上调,磷脂合成过程中关键基因转录水平均下调,可能导致了磷脂物质合成被抑制;RNAseq数据经q RT-PCR验证发现有较好的准确性。3.在p H2.0时,与出发菌株wt相比,发现:突变菌株Cgcrz1Δ细胞壁多糖β-葡聚糖含量下降了23%;突变菌株Cgcrz1Δ的单不饱和脂肪酸C16:1和C18:1百分含量分别下降10%和30%,UFA/SFA比例下降了4.47个单位,回补菌株Cgcrz1Δ/Cg CRZ1的C16:1百分含量下降15%,而C18:1百分含量提高了16%,UFA/SFA比例上升了2.07个单位;突变菌株Cgcrz1Δ的膜甾醇成分—角鲨烯、粪甾醇和麦角甾醇含量分别下降了70%、84%和30%,回补菌株Cgcrz1Δ/Cg CRZ1的角鲨烯含量下降了29.7%,粪甾醇和麦角甾醇含量分别提高了50%和40%;突变菌株Cgcrz1Δ的总磷脂含量下降,磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)含量分别下降了25%和23%,磷脂的不饱和度和碳链长度降低,突变菌株Cgcrz1Δ的总磷脂含量提高,磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)含量分别提高了48倍和1.8倍,磷脂的不饱和度和碳链长度提高。4.细胞膜脂质成分的改变影响了细胞膜的性质。在p H2.0时,与出发菌株wt相比,发现:突变菌株Cgcrz1Δ的细胞膜完整性、流动性和质子泵H+-ATPase活力分别下降了45%、9%和52%;回补菌株Cgcrz1Δ/Cg CRZ1的细胞膜完整性、流动性和质子泵H+-ATPase活力分别提高了30%、6%和17%。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
林小宝[6]（2016）在《中介体亚基CgMED3调控光滑球拟酵母适应酸环境的生理机制》一文中研究指出本论文以一株光滑球拟酵母(Candida glabrata)的叁重缺陷型(组氨酸、色氨酸和尿嘧啶)C.glabrata ATCC 55为研究对象。以解析光滑球拟酵母的酸胁迫调控机制为目标,运用转录组学、气质联用和液质联用等方法,通过比较基因CgMED3AB缺失前后细胞生长、基因转录水平与细胞膜成分,就中介体亚基CgMED3AB在光滑球拟酵母应答酸胁迫作用机制展开研究。主要研究结果如下:1.CgMed3ABp亚基缺失导致pH 2.0下菌株生长受到抑制。采用基因敲除方法构建了双缺突变株Cgmed3ABΔ,当pH 6.0时,出发菌株wt与Cgmed3ABΔ菌株都表现出相似的生长能力,培养0~3 h处于延滞期,3-15 h处于对数生长期,15 h后进入平台期,平均比生长速率0.096 h-1;pH 2.0条件下与出发菌株wt相比,基因CgMED3AB缺失菌株:培养0~21 h处于延滞期,21 h后进入对数期,菌体生物量与平均比生长速率分别为0.25 g·L-1和0.052 h-1,降低65%和40%;2.CgMed3ABp亚基影响脂质代谢路径基因表达水平。运用转录组学分析突变菌株Cgmed3ABΔ在pH 2.0条件下基因表达水平变化,发现相比于出发菌株wt:菌株Cgmed3ABΔ降低涉及萜类物质合成和甾醇合成等路径基因变化明显,表明甾醇前体物质角鲨烯在该环境下可能发生积累;脂肪酸合成代谢途径基因表达水平发生变化,相关脂肪酸延伸与合成基因发生下调,可能导致脂肪酸合成降低;甘油磷脂合成过程中关键基因发生下调,可能导致PI、PC、PE等合成受到抑制。3.CgMed3ABp亚基参与调节细胞膜脂肪酸、磷脂和甾醇合成。结合气质联用和液质联用技术,研究pH 2.0条件下与出发菌株wt相比,基因CgMED3AB缺失菌株的细胞膜脂肪酸、磷脂和甾醇含量,发现:(1)Cgmed3ABΔ细胞内角鲨烯含量,较出发菌株wt上升30倍;而且突变菌株Cgmed3ABΔ膜甾醇成分发生改变,羊毛甾醇、酵母甾醇、粪甾醇和麦角固醇比出发菌株wt分别降低88%,88%,92%和82%。(2)脂肪酸显着下降,其中主要脂肪酸C16:0、C16:1、C18:0、C18:1和C18:2含量分别为出发菌株wt的55%、54%、29%、39%和41%。(3)磷脂含量大幅度降低,其中主要的磷脂成分磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)分别比出发菌株wt降低60%和73%。4.CgMed3ABp亚基参与调节质子泵活性以及细胞膜刚性。通过荧光分光光度计结合荧光偏振法对细胞膜的刚性进行检测,对比出发菌株wt与Cgmed3ABΔ菌株在不同pH 2.0条件下细胞膜的生理性质,发现:突变菌株Cgmed3ABΔ的细胞膜刚性降低12%。另一方面,细胞膜质子泵H+-ATPase活性比出发菌株wt降低了75%。(本文来源于《江南大学》期刊2016-06-01）
靳丛丛,陈修来,陈瑞东,刘立明[7]（2016）在《光滑球拟酵母中AMP代谢对其生理功能的影响》一文中研究指出【目的】研究光滑球拟酵母(Candida glabrata)中AMP代谢影响其碳流代谢和耐酸胁迫的生理机制。【方法】同源重组法敲除基因cgade12(ORF CAGL0K05027g)和cgade13(ORF CAGL0B02794g)构建双缺菌株cgade12Δade13Δ,与出发菌株(ATCC55)比较ATP水平、碳流代谢酶活性和中间代谢物含量变化分析和AMP代谢对其碳流代谢的影响,对比菌株有机酸胁迫下生长情况及胞内环境变化,研究AMP代谢变化对光滑球拟酵母酸胁迫耐受性的影响。【结果】与出发菌株ATCC55相比,cgade12Δade13Δ的ATP水平下降了12.50%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ中柠檬酸合成酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶的活性分别上升了31.26%、19.45%、28.96%、18.36%,柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸、琥珀酸含量分别提高了44.11%、73.60%、50.00%、65.68%。胞内丙酮酸浓度下降20.00%,丙酮酸产量下降73.11%。与ATCC55相比,cgade12Δade13Δ在0.4%丙酮酸、0.6%苹果酸和0.2%乙酸胁迫下的菌体浓度分别提高了8.71%、11.21%和12.71%。在0.2%乙酸胁迫下,菌株cgade12Δade13Δ的H~+-ATPase活性、细胞膜完整度、细胞膜电势分别比出发菌株ATCC55上升了7.04%、8.71%、25.14%,ROS水平下降了19.51%。【结论】基因cgade12、cgade13的缺失导致菌株的ATP水平下降,TCA循环活性和有机酸耐受性上升。(本文来源于《微生物学报》期刊2016年07期）
靳丛丛[8]（2015）在《光滑球拟酵母中AMP代谢对其生理功能的影响》一文中研究指出本论文以C.glabrata ATCC 55为研究对象,利用分子生物学和细胞生物学的相关手段,通过检测AMP代谢基因CgAMD1、CgADE12、CgADE13缺失前后的胞内ATP水平、丙酮酸生产性能、TCA循环的代谢效率以及乙酸胁迫下的胞内微环境变化,解析了AMP代谢对菌株生理性能的影响。主要研究结果如下:(1)以C.glabrata ATCC 55为出发菌株构建了Cgamd1Δ、Cgade12Δ、Cgade13Δ和Cgade12ade13Δ。分析其胞内ATP水平变化,发现在YNB培养基中,Cgamd1Δ的胞内ATP水平比ATCC 55提高了15.38%,而Cgade12Δ、Cgade13Δ、Cgade12ade13Δ的胞内ATP水平则分别降低了7.69%、2.56%、5.12%。相同的变化趋势也出现在发酵过程中。20%溶氧水平下,Cgamd1Δ在发酵前期的胞内ATP水平提高了27.28%,而Cgade12Δ、Cgade13Δ、Cgade12ade13Δ的胞内ATP水平则分别下降了14.54%、5.74%和10.47%。(2)发酵过程中,与ATCC 55相比,Cgamd1Δ、Cgade12Δ、Cgade13Δ、Cgade12ade13Δ的代谢速率均下降,其中丙酮酸生产强度分别下降了37.50%、15.00%、75.00%、77.50%,葡萄糖消耗速率也分别下降了20.37%、15.43%、34.57%、37.04%。进一步的分析发现,Cgamd1Δ的丙酮酸生产能力提高了31.40%,而干重对葡萄糖的得率则下降了35.71%,表明碳流更倾向于丙酮酸积累。分析其原因,发现TCA循环中关键酶的活性及中间代谢产物浓度的下降,降低了TCA循环的代谢效率,使得胞内丙酮酸水平提高了103.64%。然而,Cgade13Δ和Cgade12ade13的细胞干重对葡萄糖的得率分别提高了21.42%和18.57%,丙酮酸生产能力却下降了67.44%和71.51%,表明碳流则更倾向于细胞生长。分析其原因,发现TCA循环中关键酶的活力和中间代谢物的浓度的提高,增强了TCA循环的效率。(3)比较菌株在丙酮酸、苹果酸和乙酸胁迫下的生长性能,发现0.2%乙酸胁迫下,菌株间的有机酸耐受性差异最为显着,Cgamd1Δ的菌体浓度比ATCC 55降低了55.91%,而Cgade12Δ、Cgade13Δ、Cgade12ade13的菌体浓度则分别上升了31.56%、16.44%和12.71%。分析乙酸胁迫下的胞内微环境,结果显示:CgAMD1的缺失破坏了胞内微环境,与ATCC 55相比,Cgamd1dΔ的胞内pH、H+-ATPase、细胞膜完整度分别降低了7.34%、5.61%、30.63%,ROS水平、细胞膜电势则分别上升了53.93%、148.03%;CgADE12、CgADE13的缺失则改善了胞内微环境。与ATCC 55相比,Cgade12Δ、Cgade13Δ、Cgade12ade13Δ的胞内pH、细胞膜完整度和细胞膜电势均有不同程度的提高,胞内ROS水平则分别下降了59.67%、16.98%和19.51%。(本文来源于《江南大学》期刊2015-12-01）
陈修来[9]（2015）在《系统代谢工程改造光滑球拟酵母生产富马酸》一文中研究指出本论文以光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019为研究模型,借助全基因组规模代谢网络模型i NX804(Genome scale metabolic model i NX804,GSMM i NX804)深入分析富马酸所参与的代谢途径,结合系统代谢工程与合成生物学的相关技术手段,从系统生物学水平上研究和改造快速高效的富马酸代谢路径、增强富马酸代谢路径中中间代谢物的传输效率、抑制富马酸生产过程中副产物的产生,从而降低碳流的流失、提高富马酸的积累量。主要研究结果如下:1.借助T.glabrata基因组规模代谢网络模型i NX804,对富马酸前体苹果酸合成途径进行计算,并结合文献挖掘,确定苹果酸最佳合成途径为胞质还原路径,这一途径涉及到丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH);利用代谢工程策略将源于Rhizopus oryzae的PYC和MDH,过量表达于T.glabrata中构建苹果酸合成的胞质还原途径,苹果酸积累量由0.80 g/L提高到4.8 g/L;通过对苹果酸胞质还原途径进行代谢流限制性模拟分析,发现限制胞外苹果酸高效积累的瓶颈在于转运能力弱,进而将源于Schizosaccharomyces pombe的苹果酸转运基因Sp MAE1过量表达,最终苹果酸积累量达到8.5 g/L;2.富马酸酶作为TCA循环中的重要酶,能够催化苹果酸脱水生成富马酸,是R.oryzae富马酸积累路径中的关键酶。然而,该胞质富马酸酶对底物富马酸的亲和力是对苹果酸的17倍。为了改善该酶的催化效率,采用分子对接的方法筛选出在底物结合位点B区域内具有改善催化效率的潜在突变位点H159S、H159Y、H159V、P160A、P160H、P160T、N161R、N161E、N161F、D162W、D162K和D162M。通过对富马酸酶进行定点突变,测定突变酶的动力学参数(如:Km、kcat、kcat/Km等),筛选出突变体P160A,使得Km降低了53.2%,kcat/Km提高了33.2%。最后,通过在苹果酸生产菌株T.G-PMS中表达突变体P160A,获得的工程菌株T.G-PMS-P160A能够积累5.2 g/L富马酸;3.利用线粒体工程修饰改造氧化TCA循环,构建富马酸高效合成路径,涉及的关键酶为α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase complex,KGD)、琥珀酰Co A合成酶(succinyl-Co A synthetase,SUCLG)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)。通过构建融合蛋白KGD2-SUCLG2,提高路径底物传输效率;通过控制KGD2-SUCLG2和SDH1的基因表达水平,优化富马酸合成路径。上述改造获得的工程菌株T.G-KS(H)-S(M)的富马酸积累量达到8.24 g/L。另外,通过分析以α-酮戊二酸为前体的胞内氨基酸水平(如:Glu、Gln、Lys和Pro)和涉及该氨基酸代谢的关键基因表达水平,确定了关键代谢瓶颈为精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase,ASL),并对ASL进行了过量表达。最后,利用转运子SFC1和Sp MAE1实现了富马酸的有效转运,最终改造的工程菌株T.G-KS(H)-S(M)-A-2S能够积累15.7 g/L的富马酸； 4.借助T.glabrata GSMM i NX804,挖掘所有富马酸相关的代谢途径,包括:TCA还原路径、尿素循环、嘌呤核苷酸循环和氨基酸代谢路径,并分别进行代谢工程改造研究不同路径对富马酸合成的影响,最终确认尿素循环与嘌呤核苷酸循环为富马酸生产的最佳路径,涉及的关键酶分别为精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase,ASL)和腺嘌呤琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)。当控制ASL和ADSL的表达水平分别为高和低时,工程菌株T.G-ASL(H)-ADSL(L)的富马酸积累量达到5.62 g/L。另外,借助转运工程策略,将源于S.pombe的二羧酸转运蛋白Sp MAE1在工程菌T.G-ASL(H)-ADSL(L)中进行过量表达,最终工程菌T.G-ASL(H)-ADSL(L)-Sp MAE1能够积累8.83 g/L富马酸;5.通过重新剪接碳代谢网络,选择了富马酸合成路径中的10个必需基因,并将其划分为3个模块:还原模块(PMFM模块)、氧化模块(KSSS模块)和副产物模块(RPSF模块)。通过将PMFM模块和KSSS模块分别定位到细胞质与线粒体中,能够将更多的代谢流导向富马酸合成。利用蛋白质工程,获得富马酸酶突变体P160A、构建融合蛋白Ro MDH-P160A和KGD2-SUCLG2,有效地改善了底物的传输效率;通过优化路径中基因表达强度,实现了代谢流的平衡,从而大幅度提高了富马酸的积累量。当控制Ro MDH-P160A、Ro PYC、KGD2-SUCLG2和SDH1的表达水平分别为高、高、高和中时,工程菌TGFA091-12的富马酸积累量达到20.46 g/L。另外,通过构建DNA绞手架固定Ro PYC和Ro MDH-P160A进行协同催化、合成s RNA开关s RNA-RHR2和s RNA-PDC6降低副产物的积累,进一步提高了富马酸的积累量,达到33.13 g/L。(本文来源于《江南大学》期刊2015-06-01）
俞晓霞[10]（2015）在《高盐胁迫诱导光滑球拟酵母细胞凋亡的生理机制及内外源调控策略》一文中研究指出在微生物发酵生产化学品的过程中,需要考虑的问题是:工业微生物在应对不同环境胁迫时能够诱导细胞产生类似凋亡的细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)。本文选取一株丙酮酸工业化生产菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019作为研究模型,研究高盐胁迫下细胞凋亡及其抵御策略,主要研究结果如下:(1)通过研究高盐胁迫对T.glabrata生长影响,高浓度Na Cl(70 g·L-1)抑制细胞正常生长繁殖能力,并且采用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)单染法和罗丹明/碘化丙啶(Rhodamine123/PI,Rh123/PI)双染法检测高盐胁迫下细胞活性。当细胞渗透压从987m Osmol·kg-1升至2,518 m Osmol·kg-1时,活细胞下降了16.5%和坏死性细胞增加了近两倍,而DCW(3.1 g·L-1)、丙酮酸产量(2.5 g·L-1)和葡萄糖消耗量(17.9 g·L-1)分别比对照组降低了79.7%、93.1%和77.6%。(2)通过研究高盐胁迫对T.glabrata生理特性影响,高盐胁迫使线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,?Ψm)降低或者增强;增加膜上磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻几率;提高胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS),当48 h时胞内ROS量达到最高,为对照组6.45倍;提高caspase-3酶活水平,caspase-3酶活是529.8μM·μg-1,为对照组3.2倍;提高蛋白羰基化水平,不同时间段的蛋白羰基化分别比对照组高148%、71%、99%、70%和58%;抑制胞内能量代谢(Adenosine triphosphate,ATP)能力,ATP/ADP比率降低了60.5%。借助RT-PCR技术研究相关凋亡调控蛋白表达变化,高盐胁迫使基因FIS1、SOD1和SOD2表达分别降低了65.7%、70.6%和66.7%,表明FIS1、SOD1和SOD2表达水平降低可能与细胞活性降低相关。(3)通过外源和内源策略调控高盐胁迫下T.glabrata细胞凋亡,外源策略(脯氨酸或者谷胱甘肽的添加)和内源策略(过表达FIS1,HOG1和GPD2)使活细胞升高的同时,还能有效地提高细胞的发酵效率。而且使?Ψm正常运作能力增强;PS外翻几率降低;降低胞内ROS水平、caspase-3酶活水平。然后,过表达YCA1菌株的表现则完全相反。(本文来源于《江南大学》期刊2015-06-01）
光滑球拟酵母论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
微生物在自然生长和发酵生产过程中经常会面临胁迫环境,抑制菌体生长并且降低发酵产物的产量。通过调节转录因子的表达来抵御环境胁迫已经成为一种有效的策略。本论文以一株光滑球拟酵母Candida glabrata ATCC 55为研究对象,以解析光滑球拟酵母抵御盐胁迫和酸胁迫的生理机制为研究目的,利用分子生物学和生物化学等分析方法,就转录因子CgRds2应答盐胁迫和酸胁迫的生理机制展开研究,主要结果如下:1.采用基因敲除和回补表达的方法构建了敲除菌株Cgrds2Δ和回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2,发现:在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了23.4%和39.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度和细胞存活率分别提高了10.2%和6.3%;在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度和细胞存活率分别降低了32.6%和56.9%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2的细胞浓度没有显着变化,但细胞存活率提高了17.6%。2.通过转录组数据分析发现,盐胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中糖酵解、核糖体生物合成和rRNA转录等路径中基因的转录水平显着上调;脂质代谢、MAPK信号传导和细胞周期等路径中基因的转录水平显着下调,其中脂质代谢路径中甘油磷脂代谢基因的表达量变化最为显着。进一步研究盐胁迫下CgRds2的调控机制发现,MAPK路径中的关键激酶CgHog1能够与转录因子CgRds2发生相互作用,并且CgHog1通过磷酸化CgRds2的Ser64和Thr97两个位点激活转录因子CgRds2。最后,CgHog1介导CgRds2调节甘油磷脂基因的表达、甘油磷脂组分和细胞膜完整性。在1.5 M NaCl条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中甘油磷脂基因的转录水平显著降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了30.3%和47.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中总磷脂含量和细胞膜完整性分别提高了27.2%和12.1%;磷酸化位点突变菌株Cgrds2~(2A)中Cg Rds2与甘油磷脂基因的结合程度显着降低,总磷脂含量和细胞膜完整性分别降低了29.4%和21.8%。3.通过转录组数据分析发现,酸胁迫下敲除菌株Cgrds2Δ中减数分裂、蛋白质转运和转录过程等路径中基因的转录水平显著上调;翻译过程、细胞膜生物合成、氨基酸代谢和能量代谢等路径中基因的转录水平显着下调。进一步研究酸胁迫下CgRds2的调控机制发现,钙离子响应路径中的钙调磷酸激酶CgCmk1能够与转录因子CgRds2的PAS结构域发生相互作用,激活转录因子CgRds2的表达,使其从细胞质转移到细胞核中发挥作用。最后,CgCmk1介导CgRds2调节能量代谢基因的表达、胞内ATP含量和细胞膜通透性。在pH 2.0条件下,与出发菌株wt相比,敲除菌株Cgrds2Δ中能量代谢基因的转录水平显著降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了33.5%和23.6%,而回补菌株Cgrds2Δ/CgRDS2中胞内ATP含量和细胞膜通透性分别提高了41.5%和18.8%;PAS结构域缺失菌株Cgrds2-pas中CgRds2与能量代谢基因的结合程度显着降低,胞内ATP含量和细胞膜通透性分别降低了30.7%和19.1%。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
光滑球拟酵母论文参考文献
[1].罗正山.光滑球拟酵母积累丙酮酸关键生理调控机制解析[D].江南大学.2019
[2].吴承晋.光滑球拟酵母转录因子CgRds2应答环境胁迫的生理机制[D].江南大学.2019
[3].吴静,唐蕾,刘立明.光滑球拟酵母转录因子Asg1p调控鲁棒性的生理机制[J].食品与生物技术学报.2017
[4].徐楠.光滑球拟酵母基因组规模生物模型的构建与应用[D].江南大学.2016
[5].闫冬妮.转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母应答酸胁迫的生理机制[D].江南大学.2016
[6].林小宝.中介体亚基CgMED3调控光滑球拟酵母适应酸环境的生理机制[D].江南大学.2016
[7].靳丛丛,陈修来,陈瑞东,刘立明.光滑球拟酵母中AMP代谢对其生理功能的影响[J].微生物学报.2016
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[9].陈修来.系统代谢工程改造光滑球拟酵母生产富马酸[D].江南大学.2015
[10].俞晓霞.高盐胁迫诱导光滑球拟酵母细胞凋亡的生理机制及内外源调控策略[D].江南大学.2015
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