DDX21 RNA解旋酶不同结构域的功能特点解析

论文摘要

DEAD-box家族是在生物体内普遍存在的一类高度保守的RNA解旋酶,在RNA的合成和加工、细胞发育和细胞代谢等过程中都发挥着重要作用。DDX21 RNA解旋酶是DEAD-box家族成员之一,而目前为止DDX21的酶学功能及结构特征尚未被完全了解。本研究运用生物化学与生物物理学前沿技术,系统地研究了DDX21各结构域在不同功能中发挥的作用。首先重组构建并纯化了人的DDX21 RNA解旋酶及不同的截短蛋白质,利用动态激光散射和凝胶层析技术分析各蛋白质的寡聚形态,发现N-端的非功能区（N-端181aa）与C-端的4个FRGQR重复结构域对其结构有较大的影响;利用荧光偏振技术比较分析了各蛋白质与单链RNA的结合反应,结果显示,仅保留DEADc和HELICc结构域的截短蛋白质与单链RNA完全没有亲和性,缺失N-端181aa的截短蛋白质对ssRNA的结合能力与全长蛋白质基本一致,而仅缺失C-端的4个重复FRGQR结构域的截短蛋白质与单链RNA的亲和能力将显著下降;利用快速停流检测技术分析各截短蛋白质的解旋及退火活性,发现DEADc、HELICc及GUCTRHII三个结构域共同参与DDX21的解旋功能,另一方面,缺失C-端4个FRGQR重复结构域的截短蛋白质导致退火能力的丧失。本研究揭示了DDX21的GUCTRHII结构域及C-端4个FRGQR重复结构域在其结构及功能中发挥的重要作用,为今后研究DDX21的结构及其细胞功能提供了重要的理论依据。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 工具酶及试剂
•   1.2 引物、质粒和菌株
•   1.3 核酸底物的制备
•   1.4 DDX21 RNA解旋酶及其截短突变体蛋白质表达载体的构建
•   1.5 DDX21 RNA解旋酶及其截短突变体蛋白质的诱导表达与纯化
•   1.6 DLS检测DDX21 RNA解旋酶及不同截短突变体蛋白质的寡聚形式
•   1.7 SEC 检测DDX21 RNA解旋酶及不同截短突变体蛋白质的寡聚形式
•   1.8 不同结构域的DDX21 RNA解旋酶与单链RNA底物的结合反应检测
•   1.9 全长DDX21及不同截短DDX21蛋白的解旋反应
•   1.10 全长DDX21及不同截短突变体DDX21蛋白的退火反应
•   1.11 统计学分析及实验数据处理
• 2 结果
•   2.1 全长DDX21及不同结构域的DDX21 RNA解旋酶蛋白表达载体的构建与原核表达纯化
•   2.2 各蛋白质寡聚形态的测定
•   2.3 DDX21的C-端结构域对其与ssRNA亲和力的影响
•   2.4 DDX21解旋酶的解旋动力学的方向性初步分析及最佳反应条件探索
• RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋作用'>  2.5 DEADc、HELICc、及GUCT_RHII三个结构域共同参与DDX21的解旋作用
•   2.6 C-端4个重复的FRGQR结构域在DDX21退火过程中的作用
• 3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 谢艳,张倩,刘娜女,奚绪光

关键词: 解旋酶,荧光偏振技术,快速停流检测技术,解旋活性,退火活性

来源: 中国生物化学与分子生物学报 2019年04期

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学

单位: 西北农林科技大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室

基金: 国家自然科学基金项目(No.31660241)~~

分类号: Q75

DOI: 10.13865/j.cnki.cjbmb.2019.04.14

页码: 446-456

总页数: 11

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