导读:本文包含了侵染性克隆论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:病毒,甜瓜,基因组,柑橘,载体,斑点,斑驳。
侵染性克隆论文文献综述
吴会杰,彭斌,康保珊,刘丽锋,刘莉铭[1]（2019）在《携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体构建》一文中研究指出甜瓜坏死斑点病毒(Melora necrotic spot virus,MNSV)是中国新近报道为害甜瓜的病毒种。本研究首先从田间采集确认是MNSV侵染的甜瓜叶片,采用分段扩增的方式,获得了该病毒的cDNA全长基因。随后以双元载体pXT1为骨架质粒,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组酶连接pXT1和MNSV全长cDNA片段,获得含MNSV cDNA全长基因的pXT1-MNSV克隆,接种甜瓜,通过症状观察及PCR检测鉴定其致病性。取接种pXT1-MNSV载体后发病明显的甜瓜叶片,经汁液摩擦接种到健康的甜瓜上,验证其是否能通过汁液摩擦接种。在此基础上,利用同源重组的方法将GFP去掉终子密码子的全长基因重组到MNSV cp基因后面,接种甜瓜后,通过观察接种植株的症状及PCR检测其侵染性,并利用激光共聚焦观察甜瓜根部及叶片,均出现GFP荧光。本研究首次在国内构建了携带GFP的MNSV侵染性克隆载体,为解析病毒的分子机理以及在侵染过程中病毒的分布与运动奠定了基础。(本文来源于《中国植物病理学会2019年学术年会论文集》期刊2019-07-20）
刘莉铭,解昆仑,彭斌,刘美,吴会杰[2]（2019）在《农杆菌介导的南瓜花叶病毒cDNA侵染性克隆的构建》一文中研究指出南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)属于豇豆花叶病毒属的成员,能够侵染甜瓜、南瓜、西瓜、黄瓜等葫芦科作物,可通过机械方法、种子和介体昆虫进行传播。由于该病毒的种传率较高,且该病毒的侵染可以引起植株叶片花叶、皱缩,开花果实期时病害更为严重,对葫芦科作物的种植生产造成了极大的威胁。本研究利用RT-PCR对南瓜花叶病毒CH 99/211分离物的两条基因组分别进行了分段扩增,并利用同源重组技术将2条基因组序列分别构建到植物表达载体pXT1中,获得该病毒的cDNA侵染性克隆pSqMV-RNA1和pSqMV-RNA2。利用农杆菌介导的方式将pSqMV-RNA1和pSqMV-RNA2同时接种西葫芦,在接种初期,西葫芦新叶产生褪绿斑点,之后随着接种时间的延长,花叶症状逐渐明显。将发病叶片研磨成汁液,经机械摩擦方式进一步接种西瓜、甜瓜、黄瓜和本生烟,通过观察接种植株症状的变化和RT-PCR检测,发现它可以侵染甜瓜和黄瓜,但不能侵染西瓜和本生烟。以上结果说明该侵染性克隆产生的病毒后代具有生物学活性,南瓜花叶病毒的cDNA侵染性克隆构建成功。本研究为SqMV侵染性克隆成功获得的首次报道,为该病毒各基因功能的研究及致病机制的揭示奠定了基础,也为该病毒种传机制的研究提供了新方法。(本文来源于《中国植物病理学会2019年学术年会论文集》期刊2019-07-20）
吴会杰[3]（2019）在《SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定》一文中研究指出甜瓜(Cucumis melo)是我国重要的经济作物之一。近年来,新突发病毒病严重影响甜瓜产业发展。中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus)和甜瓜坏死斑点病毒(melon necrotic spot virus)是中国新近报道为害甜瓜的种。为阐明两种病毒的致病机理,构建了SLCCNV和MNSV两种甜瓜病毒的侵染性克隆,分析了病毒编码的病毒致病因子,以期为防控该病毒病奠定基础。目前取得以下结果:1、鉴定了甜瓜是SLCCNV的新寄主,构建了SLCCNV侵染性克隆并进行了烟粉虱传染试验。测定了SLCCNV-HN全基因组序列并进行了系统进化分析,结果表明SLCCNV-HN甜瓜分离物与SLCCNV-Hn南瓜分离物、SLCCNV-Hn61和SLCCNV-SY西葫芦分离物聚为一类。构建了SLCCNV-HN侵染性克隆载体,接种甜瓜后植株矮化、叶片皱缩。进行了烟粉虱传染试验,发现烟粉虱接种的植株表现出与接种野生型一致的症状。2、明确了AC5基因是SLCCNV的致病因子,证实了AC5是SLCCNV编码的沉默抑制子,其沉默抑制活性与核定位信号相关。将表达AC5基因的PVX异源载体接种本氏烟后叶片表现枯斑、皱缩,表明AC5是致病因子并激发了植物的过敏性坏死反应,DAB染色说明过敏性坏死反应与H_2O_2的积累相关。不仅如此,利用SLCCNV侵染性克隆定点突变AC5基因,进一步证实了AC5基因是该病毒的致病因子。利用p35S-AC5与p35S-GFP共浸润接种16c本氏烟,接种5 d后接种部位出现明显的绿色荧光信号,表明了AC5基因可抑制局部沉默。利用p35S-GFP、p35S-dsGFP和p35S-AC5共浸润野生本氏烟,接种5 d后在接种部位未发现绿色荧光信号,表明AC5不抑制双链GFP(IR-PTGS)诱导的沉默。在AC5基因ORF之前引入终止密码子,明确了AC5是在蛋白水平发挥作用。利用AC5核定位信号缺失突变体与p35S-GFP共浸润16c本氏烟,发现该突变体失去了沉默抑制作用,表明AC5蛋白的核定位信号与沉默抑制活性相关。3、证实了p42是MNSV的致病因子,与寄主因子3-羟基异丁酸脱氢酶(3-Hydroxyisobutyrate dehydrogenase-like 1,3HID1)互作。将表达p42基因的PVX异源载体接种本氏烟后植株新叶枯死,证实p42是MNSV的致病因子。构建了MNSV侵染性克隆,在此基础上构建了携带GFP的MNSV侵染性克隆载体。在MNSV侵染性克隆的基础上进行了p42基因突变,发现p42的R-domain和S-domain是致病功能域。此外,构建了受MNSV侵染的甜瓜cDNA文库,筛选到与p42互作的6个寄主因子,经酵母双杂交、BIFC及共定位一对一验证,表明3HID1与p42互作,本研究为揭示p42与寄主互作的机制奠定了基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2019-06-01）
郭洁[4]（2019）在《小麦品种对黄矮病抗性鉴定及BYDV-GAV侵染性克隆接种研究》一文中研究指出小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)侵染引起的小麦重要病毒病害,在我国北方冬麦区常造成严重的产量损失。BYDVs由多种蚜虫持久专化性传播,病毒在蚜虫体内循回非增殖存在。BYDV-GAV作为我国小麦黄矮病的主要病原。筛选鉴定抗性品种是控制小麦黄矮病的重要方法。利用侵染性克隆进行反向遗传学研究是解析BYDV-GAV的基因功能和致病机制的重要方法。本研究分别利用田间抗性测验法及薄膜饲毒技术,对多种小麦品种(系)进行了黄矮病抗性鉴定,并对BYDV-GAV侵染性克隆进行了病毒传播探索,主要结果如下:1.采用堆测法鉴定96个小麦品种对黄矮病的抗性,扬麦158、陕229、陕研582、西农211、西农59、福麦2号、西农979等小麦品种的病情指数较低,受BYDV的影响小,表现出较好的抗性。亿阳106、小偃16、西安118、凌科608、东方红1号、西农151、西纯958、平原50等小麦品种的病情指数均高于50,表现为高感,其他品种均为感病。BYDV侵染小麦后,小麦株高、穗长、千粒重、叶绿素含量降低;激素JA、SA含量降低,植物生长调节剂BR含量降低,激素ABA、IAA含量升高;SOD、POD、CAT、MDA酶活性升高。2.采用薄膜饲毒的方法,借助介体蚜虫将pCass-GAV-RZ侵染性克隆表达得到的BYDV-GAV病毒粒子从本氏烟中转接到小麦上,经检测,病毒粒子能够在小麦中转录和复制,且能够再次侵染小麦,具有正常的侵染活性。这些工作为筛选、利用小麦黄矮抗性资源,以及分析BYDV-GAV致病性提供了数据支持和理论依据。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-10）
李正男,马强,赵明敏[5]（2018）在《葡萄病毒B内蒙古分离物基因组序列分析及其侵染性克隆的构建》一文中研究指出葡萄皱木复合病(Rugose wood comples,RW)是葡萄上普遍发生且危害严重的一类病毒病,研究证明该病害与葡萄病毒B(GVB)的侵染相关,内蒙古乌海地区是内蒙古最大的葡萄产区,为了明确内蒙古地区GVB的基因组特征,我们设计了2对扩增引物结合RACE技术,成功获得了GVB-WH分离物的全长基因组序列,该分离物基因全长为7600 nt,与NCBI中报道的7个GVB全长基因组序列核酸一致性为84.0%～90.0%,基因组结构与已报道的7个GVB分离物相同,基于全长基因组序列的系统发育分析结果表明GVB-WH分离物可以单独形成分支。为开展GVB与寄主互作研究,我们采用融合克隆的方法将GVB-WH全长基因组与pCass4-Rz载体融合,成功构建了重组质粒pCaGVB-WH,将构建的质粒转入农杆菌GV3101后注射接种西方烟,接种10d后西方烟表现为黄化、卷叶、枯死等症状,RT-PCR检测以及病毒负染观察结构都验证病毒成功侵染。本研究获得的GVB-WH分离物与已报道GVB分离物基因组序列有较高变异度且生成新的系统发育树分支,成功构建了具有生物活性的GVB侵染性克隆载体,为进一步开展GVB与寄主互作研究奠定了基础。(本文来源于《中国植物病理学会2018年学术年会论文集》期刊2018-08-24）
蒋西子[6]（2018）在《SVBV-AH侵染性克隆的构建及森林草莓RD21蛋白与SVBVP6蛋白的互作》一文中研究指出草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)属于花椰菜花叶病毒属,本研究克隆了SVBV安徽分离物(SVBV-AH)的全长基因组;利用SVBV-AH全长成功完成侵染性克隆的构建,明确了安徽分离物侵染森林草莓(Fragaria vesca)引起的表型。本课题组已证明SVBV编码的P6蛋白是一个沉默抑制子、反式激活因子和症状决定子,与致病性密切相关。但迄今为止,SVBV P6蛋白与森林草莓蛋白互作的研究尚未见报道。本课题组构建感染SVBV的森林草莓酵母cDNA文库,以P6为诱饵蛋白筛选出与其互作的寄主因子半胱氨酸蛋白酶RD21。利用酵母双杂交实验(Y2H)验证P6蛋白和RD21蛋白在体外互作,且RD21蛋白能抑制P6在植物体内的表达,为进一步揭示SVBV P6蛋白与草莓半胱氨酸蛋白酶RD21互作分子机制为研究寄主植物和病毒之间防御和反防御机理奠定基础。1 SVBV安徽分离物全长基因组的克隆提取于安徽长丰采集到的疑似被SVBV侵染的草莓样本总DNA。PCR以此为模板分段扩增出SVBV-AH片段,拼接后获得pSVBV-AH全长基因组。SVBV-AH基因组序列全长7862 bp,序列登录号为KX787430。比对基因组全序列发现,SVBV-AH与SVBV-BJ及SVBV-SY全基因组序列相似性极高,分别达到97.7%和98.5%,与SVBV-US的序列相似性较高达到85.6%,而与花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)其他成员全长基因组序列相似性较低,仅达到43.4%~44.7%。进一步比对各ORFs核苷酸序列发现SVBV-AH和SVBV-US的ORF II序列差异最大,相似性仅为69.6%,ORF V序列差异最小,相似性为86.5%,说明SVBV在和草莓相互适应过程中不会因为地理隔离发生较大的变异。2 SVBV-AH侵染性克隆的构建及其侵染性鉴定利用SVBV全长基因组克隆pSVBV-AH构建SVBV-AH侵染性克隆pBIN-1.25AHSVBV,转化农杆菌GV3101,接种森林草莓验证侵染性。6周后观察发现,接种SVBV-AH侵染性克隆的森林草莓表现明显的叶脉镶边黄化症状,而接种pBINPLUS的栽培草莓不表现明显症状。Southern blot检测表明,SVBV-AH侵染性克隆可以成功侵染森林草莓。3酵母双杂(Y2H)验证P6与RD21互作pGBK-P6+pGAD-RD21、pGBK-P6+pGAD-RD21分别共转化酵母Y2H;在SD/-Ade/-His和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/不同营养缺陷型培养基培养。结果发现,共转化的酵母菌能够在营养缺陷型培养基上生长,说明P6能够与RD21在体外互作。4森林草莓RD21基因的序列比较及分子进化分析将本研究克隆获得的森林草莓RD21基因与已登录在GenBank的其他植物的RD21基因进行核甘酸序列相似性比较,结果发现,森林草莓半胱氨酸蛋白酶RD21的核苷酸序列与同属蔷薇科的梅花(Prunus mume)、苹果(Malus x domestica)、樱桃(Prunus avium)、梨(Pyrus x bretschneider)和桃(Prunus persica)的核苷酸序列相似性较高,为83.5%-84.8%,与其他植物RD21基因序列的相似性较低,为67.4%-76.5%。构建森林草莓RD21基因和其他植物RD21基因系统发育进化树,结果表明森林草莓RD21基因与同属蔷薇科植物的梅花(P.mume)、苹果(M.domestica)、樱桃(P.avium)、梨(P.bretschneideri)和桃(P.persica)RD21基因单独聚为一个分支,表明森林草莓RD21基因与蔷薇科植物RD21基因的亲缘关系最近。5 Real-time PCR分析森林草莓RD21基因的RNA积累水平SVBV-US侵染性克隆侵染森林草莓35天后,提取发病新叶总RNA,Real-time PCR分析接种空菌株草莓和接毒草莓中RD21基因的表达差异,结果表明,SVBV-US侵染的森林草莓中RD21表达上调。6森林草莓RD21亚细胞定位及与P6蛋白共定位分析含质粒pCM2300-RD21-GFP和pCM2300-P6-RFP的农杆菌共浸润本氏烟,结果表明,RD21蛋白能够定位于本氏烟的细胞质、细胞核边界,共定位实验发现,P6蛋白能够与RD21蛋白共定位于细胞边界。7森林草莓RD21抑制P6在植物体内的表达将含有pGR106-P6-GFP/pGR106和pGR106-P6-GFP/pGR106-RD21表达载体的农杆菌分别注射本氏烟,4天后UV灯下观察荧光发现,pGR106-P6-GFP/pGR106-R D21浸润的叶片中绿色荧光较弱,提取浸润区蛋白进行检测,结果发现检测不到P6蛋白的表达,同时检测P6 mRNA发现,P6 mRNA表达水平一致,说明RD21蛋白能够抑制P6-GFP的表达。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2018-06-01）
崔甜甜[7]（2018）在《柑橘黄化脉明病毒和柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆构建》一文中研究指出柑橘病毒病害每年都会对世界柑橘产业造成严重的经济损失。柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow clearing vein virus,CYVCV)作为2009年我国发现侵染柑橘的一种新病毒,会引起柠檬和酸橙嫩叶脉明、黄化、叶片反卷和皱缩等症状,严重时可导致嫩叶脱落、叶脉坏死,造成树势衰弱、果实产量下降,有时甚至绝收;近几年,该病毒在我国柑橘产区的发生呈现逐年上升趋势,已经成为影响我国柑橘产业尤其是柠檬产业的一个重要问题。柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)是乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)柑橘病毒属(Citrivirus)的代表成员,可侵染大多数的柑橘品种,中国于2016年在甜樱桃和猕猴桃上首次发现,后续在柠檬上也有报道。目前对CYVCV和CLBV的分子特性和生物学特性研究较少,而植物病毒侵染性克隆是研究病毒基因功能的重要工具。然而利用大肠杆菌构建基因组较大的病毒全长侵染性克隆时,会出现基因组结构(突变及缺失)不稳定的现象。因此本研究首先分别对CYVCV和CLBV分离物进行了全长cDNA的扩增,然后通过基于酵母转化的同源重组(transformation-associated recombination,TAR)技术分别成功构建了CYVCV和CLBV的基因组全长侵染性克隆,为进一步研究两种病毒的分子生物学特性、致病机理及其载体化应用奠定了基础。所取得的主要研究结果如下:1、病毒侵染性克隆的快速构建体系本研究利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和含有酵母相关复制起始位点的片段pYES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制和表达的叁元穿梭载体pCY(Genbank登录号:MG637043);进而建立了基于pCY及TAR技术的快速克隆体系,然后利用Potato Virus X(PVX)对该体系进行验证,在2周内获得了PVX侵染性克隆。2、CYVCV侵染性克隆构建本研究建立了CYVCV基因组的一步法RT-PCR扩增体系;通过TAR技术克隆至叁元载体pCY,成功获得柑橘黄化脉明病毒四川安岳分离物基因组全长cDNA克隆,测序结果表明CYVCV-AY基因组为7529 bp,包含6个开放阅读框,与目前已报道的CYVCV分离株一致。选取一致序列进行提交并命名为:CYVCV-AY(Genbank登录号:MG878869);序列比对结果显示,随机选取的4个CYVCV-AY基因组全长cDNA克隆的核苷酸序列相似性均在99%以上;在系统进化树上,CYVCV-AY的4个克隆均与柑橘来源的CYVCV分离株聚为一簇。通过TAR克隆在国内外首次获得了CYVCV的侵染性cDNA克隆,症状观察及RT-PCR检测结果表明,所获得的pCY-CYVCV具有侵染性。农杆菌介导接种试验表明,接种方式和所选取的寄主对侵染效率有较大影响;所获得的pCY-CYVCV全长cDNA采用农杆菌介导的真空浸润柑橘,其侵染效率比较高。3、CLBV侵染性克隆构建利用所建立的柑橘病毒侵染性克隆的快速构建体系,首次获得了CLBV中国分离株的侵染性克隆HBYD(Genbank登录号:MG572236)。序列测定显示,CLBV-HBYD基因组长度及结构与目前已报道的来自柑橘的CLBV分离株一致,为8747 bp,包含3个开放阅读框,ORF1为5889 nt、ORF2为1089 nt、ORF3为1092 nt,5′端有甲基化帽子结构,3′末端具有poly(A)。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性在79%~98%,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在系统进化树上,MG572236与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇。在侵染性克隆的基础上,构建了插入亚基因组启动子及GFP基因开放读码框的pCLBV表达载体。(本文来源于《西南大学》期刊2018-05-15）
崔甜甜,晏建红,宾羽,李中安,周常勇[8]（2018）在《利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆》一文中研究指出【目的】构建柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)中国分离株的侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础。【方法】以Gene Art?p YES1L Vector为模板,PYES2117F、PYES2117R为引物扩增含有酵母相关复制起始位点的片段p YES1L-2117,利用限制性内切酶Sac II单酶切双元载体DK1317-2并回收其大片段,利用In-Fusion HD Cloning Kit重组连接双元载体DK1317-2骨架和片段p YES1L-2117,得到可以在酵母-农杆菌-大肠杆菌中复制的叁元穿梭载体pCY。以马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)全长cDNA侵染性克隆为模板,pCY-PVX-F、pCY-PVX-R为引物扩增PVX全长,采用限制性内切酶Stu I、Sma I酶切质粒pCY,采用醋酸锂转化法将获得的PVX基因组全长cDNA与线性化的pCY载体共转化酵母菌YPH501,通过同源重组获得PVX基因组全长cDNA克隆。通过农杆菌介导接种本生烟验证所构建克隆的侵染性,从而建立基于酵母同源重组的病毒侵染性克隆快速构建体系。在此基础上,以CLBV中国分离物(CLBV-HBYD)全长cDNA为模板,分段扩增其基因组,得到片段CLBV-1、CLBV-2;利用所建体系对CLBV-1、CLBV-2及pCY载体片段进行同源重组。得到重组质粒pCY-CLBV后,经农杆菌介导接种本生烟和锦橙幼苗,并利用RT-PCR和Northern blot检测其侵染性。【结果】建立了酵母-大肠杆菌-农杆菌的叁元穿梭载体PCY,该载体全长10 347 bp,含有酵母、农杆菌、大肠杆菌的复制位点,能在酵母-农杆菌-大肠杆菌稳定复制,可用于在酵母中通过同源重组快速构建病毒基因组全长cDNA克隆,也可用于通过农杆菌介导直接接种植物寄主。利用该体系获得了CLBV中国分离株的基因组全长cDNA克隆16个。随机选取1个克隆进行了序列测定(Gen Bank登录号:MG572236),其基因组全长8 747 nt,包含3个开放阅读框(open reading frame,ORF),ORF1为5 889 nt、ORF2为1 089 nt、ORF3为1 092 nt。全基因组序列比对显示,CLBV-HBYD与已登录的9个CLBV分离物的核酸序列一致性为79%—98%,其中与柑橘来源的EU857540一致性最高,为98%,与猕猴桃来源的JN983454、JN983455、JN983456和JN900477的一致性均为79%。在利用MEGA6软件构建的系统发育树上,CLBV-HBYD与柑橘来源的CLBV分离株聚为一簇,而猕猴桃来源的CLBV分离株聚为另一簇。将所获16个CLBV全长cDNA克隆转化农杆菌,以pCY空载体为阴性对照注射接种本生烟。接种20 d后,抽提RNA进行RT-PCR检测,结果表明11个克隆的接种植株检测出CLBV特异性条带;随机选取5个阳性克隆进一步进行了Northern blot杂交,结果显示pCY-CLBV 1、2、3、14、15接种的本生烟可以检测到CLBV特异性条带,而对照样本未检测到任何条带,表明这些克隆均为侵染性克隆。【结论】构建了基于叁元穿梭载体pCY的酵母重组克隆体系,利用该体系获得了中国CLBV分离株的适于农杆菌介导接种的基因组全长cDNA侵染性克隆。(本文来源于《中国农业科学》期刊2018年09期）
张双纳[9]（2018）在《苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测技术研究及侵染性克隆载体构建》一文中研究指出苹果是主要的经济果树。在苹果的高产优质生产中,病毒病害已经成为制约苹果产业发展的重要因素。在世界范围内苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)在苹果上检出率最高,为害最严重,地理分布最广的苹果病毒病之一。基于我国对ACLSV的研究现状且对苹果高质安全生产的迫切需求,本文旨在完成以下实验:利用反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术,建立一种简便、快速检测ACLSV的检测方法;以带有ACLSV的辽宁兴城寒富苹果(Malus domestica cultivar Hanfu)为研究材料,采用RT-PCR结合RACE技术,扩增了该ACLSV分离物的全长基因组;构建了ACLSV侵染性克隆载体,为后续开展ACLSV复制、移动,与寄主互做等致病机理研究,改造用于苹果基因功能研究的基因沉默载体奠定基础。具体研究成果如下:1、建立了ACLSV RT-LAMP检测方法,优化的各反应物浓度为:6.0 mM Mg~(2+)、1.2 mM dNTPs、1.0 M Betaine、1.6μM FIP/BIP和0.2μM F3/B3引物,59℃反应60 min;特异性测试中,仅ACLSV检测结果为阳性,对照组均为阴性;灵敏性测试中,此法最低可检测到10~(-3)倍RNA稀释液;随机采取的23株苹果叶片样品RT-PCR阳性检出率为52.2%,RT-LAMP法检测ACLSV,阳性检出率为65.2%,RT-LAMP的检出率高于RT-PCR,表明RT-LAMP具有较高的灵敏性。2、ACLSV XC-HF分离物基因组全长7557个核苷酸(nt),编码3个ORF,与已经报道的19个ACLSV分离物基因组核苷酸序列的一致性为68.9%~84.4%。基于全长基因组序列的系统发育分析证明,Genbank登录的20个ACLSV分离物被划分为6个组,ACLSV XC-HF分离物位于JB组内,与中国梨分离物JB、KMS、YH和中国山楂分离物SY03聚为一支;重组分析结果显示该分离物为一个自然重组产物,重组区域发生在1-338nt。3、通过摩擦接种和木本指示植物双芽嫁接法分别将该分离物接种到草本寄主苋色黎(Chenopodiu mamaranticolor)和木本指示植物俄罗斯苹果(Malus sylvestris cv.R12740-7A)上,该分离物在这两种寄主上分别引起褪绿和皱缩症状。4、本实验成功构建了ACLSV侵染性克隆载体,接种后的西方烟出现了感染ACLSV的症状,叶片黄化褪绿,经凝胶电泳检测ACLSV呈阳性。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2018-03-01）
黄显德,王玉,程德杰,刘锦,闫志勇[10]（2017）在《番木瓜环斑病毒西瓜株系侵染性克隆的构建及应用》一文中研究指出利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR获得了番木瓜环斑病毒西瓜株系山东分离物(PRSV-SD)的全基因组序列。PRSV-SD基因组(GenBank登录号为MF085000)全长10 337个核苷酸(nucleotides,nt),5′-和3′-非翻译区分别为90nt和206nt,含有一个开放阅读框,编码3 346个氨基酸的多聚蛋白。PRSV-SD与GenBank中18个PRSV分离物的全基因组核苷酸一致率为82.05%~89.3%,多聚蛋白的氨基酸一致率为90.6%~94.7%。构建了可通过农杆菌浸润接种的侵染性克隆pCamPRSV,可侵染西瓜、甜瓜、西葫芦、黄瓜等葫芦科作物。通过在PRSV核内含体蛋白b(NIb)和衣壳蛋白(CP)基因之间插入绿色荧光蛋白(GFP)基因,得到pCamPRSV-GFP,在紫外灯下可观察到绿色荧光。(本文来源于《中国植物病理学会2017年学术年会论文集》期刊2017-07-25）
侵染性克隆论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)属于豇豆花叶病毒属的成员,能够侵染甜瓜、南瓜、西瓜、黄瓜等葫芦科作物,可通过机械方法、种子和介体昆虫进行传播。由于该病毒的种传率较高,且该病毒的侵染可以引起植株叶片花叶、皱缩,开花果实期时病害更为严重,对葫芦科作物的种植生产造成了极大的威胁。本研究利用RT-PCR对南瓜花叶病毒CH 99/211分离物的两条基因组分别进行了分段扩增,并利用同源重组技术将2条基因组序列分别构建到植物表达载体pXT1中,获得该病毒的cDNA侵染性克隆pSqMV-RNA1和pSqMV-RNA2。利用农杆菌介导的方式将pSqMV-RNA1和pSqMV-RNA2同时接种西葫芦,在接种初期,西葫芦新叶产生褪绿斑点,之后随着接种时间的延长,花叶症状逐渐明显。将发病叶片研磨成汁液,经机械摩擦方式进一步接种西瓜、甜瓜、黄瓜和本生烟,通过观察接种植株症状的变化和RT-PCR检测,发现它可以侵染甜瓜和黄瓜,但不能侵染西瓜和本生烟。以上结果说明该侵染性克隆产生的病毒后代具有生物学活性,南瓜花叶病毒的cDNA侵染性克隆构建成功。本研究为SqMV侵染性克隆成功获得的首次报道,为该病毒各基因功能的研究及致病机制的揭示奠定了基础,也为该病毒种传机制的研究提供了新方法。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
侵染性克隆论文参考文献
[1].吴会杰,彭斌,康保珊,刘丽锋,刘莉铭.携带GFP的甜瓜坏死斑点病毒侵染性克隆载体构建[C].中国植物病理学会2019年学术年会论文集.2019
[2].刘莉铭,解昆仑,彭斌,刘美,吴会杰.农杆菌介导的南瓜花叶病毒cDNA侵染性克隆的构建[C].中国植物病理学会2019年学术年会论文集.2019
[3].吴会杰.SLCCNV和MNSV侵染性克隆的构建及致病因子鉴定[D].华中农业大学.2019
[4].郭洁.小麦品种对黄矮病抗性鉴定及BYDV-GAV侵染性克隆接种研究[D].西北农林科技大学.2019
[5].李正男,马强,赵明敏.葡萄病毒B内蒙古分离物基因组序列分析及其侵染性克隆的构建[C].中国植物病理学会2018年学术年会论文集.2018
[6].蒋西子.SVBV-AH侵染性克隆的构建及森林草莓RD21蛋白与SVBVP6蛋白的互作[D].安徽农业大学.2018
[7].崔甜甜.柑橘黄化脉明病毒和柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆构建[D].西南大学.2018
[8].崔甜甜,晏建红,宾羽,李中安,周常勇.利用酵母同源重组系统快速构建柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆[J].中国农业科学.2018
[9].张双纳.苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测技术研究及侵染性克隆载体构建[D].中国农业科学院.2018
[10].黄显德,王玉,程德杰,刘锦,闫志勇.番木瓜环斑病毒西瓜株系侵染性克隆的构建及应用[C].中国植物病理学会2017年学术年会论文集.2017
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