（黑龙江省农垦总局总医院，哈尔滨，150000）
课题来源黑龙江省卫生计生委科研课题（2016-458）
【摘要】目的：证明miR-let-7a与PKM2的信号通路有密切关系,miR-let-7a拮抗PKM2的表达会产生一定抗非IgA肾炎细胞增殖。方法：1.运用Real-timePCR检测miR-let-7a在非IgA肾炎细胞和正常肾脏组织、细胞中的表达情况；2.免疫组织化学方法、Real-timePCR和Westernblot分别检测PKM2在非IgA肾炎细胞和正常肾脏组织、细胞中的表达情况；证实miR-let-7a与PKM2mRNA、蛋白呈负相关性。结果：我们发现miR-let-7a在非IgA肾炎细胞表达减少,然而,PKM2在非IgA肾炎细胞细胞表达增加(p<0.001)。据统计,miR-let-7a、PKM2mRNA和PKM2蛋白负相关(分别为p=0.013,p=0.013)。结论：我们的结果表明,miR-let-7a通过下调PKM2来抑制非IgA肾炎细胞。miR-let-7a/PKM2通路对非IgA肾炎细胞病人可能是一个新的治疗靶点。
【关键词】miR-let-7a;PKM2;非IgA肾炎细胞。
根据近年来报道,miRNAs在非IgA系膜增生性肾小球肾炎形成中发挥重要作用。miR-let-7a发挥功能是通过结合调节非IgA系膜增生性肾小球肾炎的靶向基因，调控靶向基因的信号通路，从而影响非IgA系膜增生性肾小球肾炎细胞的生物行为。丙酮酸激酶M2(PKM2)作为肾脏细胞依赖的糖酵解代谢中的关键酶，抑制PKM2的表达可以抑制肾脏细胞的生长和存活。有实验证明miR-let-7a与PKM2的信号通路有密切关系,miR-let-7a拮抗PKM2的表达会产生一定抗非IgA系膜增生性肾小球肾炎效应。
1.材料和方法
1.1道德声明
人类组织样本用于本研究得到病人或其家属的书面知情同意。本研究经伦理委员会的批准黑龙江省农垦总局总医院。
1.2标本
非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织35例，正常肾脏组织12例，经过石蜡包埋并进行H&E染色的芯片。两位病理科医生进行病理检查明确诊断。
1.3细胞系
本实验所选用的正常肾脏组织是从肾活检中，排查出没有潜在的病理学疾病；样本收集前3个月，没有接受激素治疗。非IgA系膜增生性肾小球肾炎细胞系，购自美国标准培养物细胞库，将细胞常规培养在37℃，5%CO2下含有5%牛胚胎血清的DMEM中。
1.4方法
1.4.1免疫组化IHC检测PKM2抗体在非IgA系膜增生性肾小球肾炎及正常组织中的表达情况。
1.4.2细胞转染本实验小干扰RNA（siRNA）进行转染，分别是miR-let-7amimics,miR-let-7ainhibitor和miR-let-7aNC对照组，参照LipofectamineTM2000说明书。
1.4.3Real-timeRT-PCR1）RNA的提取，2）cDNA第一链的合成，3）PCR扩增反应，4）PCR结果分析：实验所得数据采用2–Ct方法进行分析。
1.4.4Westernblot，1）蛋白的提取及浓度测定，配置蛋白提取液（细胞裂解液。2）配胶。3)电泳。4）孵育一抗
1.4.5统计学方法
本实验采用统计学软件包SPSS17.0，进行统计分析，所有数据结果均以x±s表示，P<0.05被认为差异有显著意义。
2结果
2.1miR-let-7a在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa和HeLa细胞系中表达减少
首先，我们使用定量RT-PCR分析研究了35对非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织中miR-let-7a的表达，与正常组织相比，疾病组织中miR-let-7a的表达显着降低。半定量RT-PCR分析显示，与正常组织相比，疾病中miR-let-7a的表达确实降低。与组织相一致，SiHa和HeLa细胞系与人正常细胞比较,miR-let-7a也显示明显的表达下调(P<0.001）（图-1）。我们的研究结果表明miR-let-7a在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa和HeLa细胞系中表达减少。
图-1、miR-let-7a在人非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织和细胞系中的表达。（A）通过RT-PCR分析检测代表性的三个样品和细胞系中的相对miR-let-7a信使RNA表达水平，包括SiHa和HeLa。每个条代表三次独立实验的平均值。（B）35例非IgA系膜增生性肾小球肾炎和配对正常组织中miR-let-7a表达的实时PCR分析。除非另有说明，所有数据均表示为至少三次重复实验的平均值±SEM。*表示通过t检验，P<0.001的显着性。
2.2PKM2在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa和HeLa细胞系中表达升高
PKM2表达与miR-let-7a相关，因此我们利用RT-PCR，qRT-PCR和westernblot方法探讨和分析了非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织和细胞系中PKM2的表达。与正常组织相比，我们证实PKM2mRNA表达明显升高。与组织相一致，SiHa细胞和HeLa细胞系也显示，mRNAPKM2的表达，与人正常细胞比较显著升高（P<0.001）（图-2）。Western印迹分析进一步鉴定了PKM2蛋白的表达在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa细胞和HeLa细胞系显着升高，（P<0.001）（图-3）。
图-2.PKM2mRNA在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织和细胞系中，与正常组织和细胞相比，表达明显升高。定量分析定义为PKM2mRNA与GAPDH的相对密度。GAPDH被用作内部控制。显示的结果是重复独立实验的平均值±SEM。
图-3.PKM2蛋白在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织、SiH和HeLa细胞系的表达，与人正常组织和细胞比较显著升高。使用westernblot检测35例疾病组织，配对正常组织和细胞系（包括SiHa和HeLa）中PKM2蛋白的表达。平均PKM2表达标准化为β-肌动蛋白表达。除非另有说明，所有数据均表示为至少三次重复实验的平均值±SEM。*表示生P<0.001的显着性t检验。
结果：
我们发现miR-let-7a在非IgA肾炎细胞表达减少,然而,PKM2在非IgA肾炎细胞细胞表达增加(p<0.001)。据统计,miR-let-7a、PKM2mRNA和PKM2蛋白负相关(分别为p=0.013,p=0.013)。我们的结果表明,miR-let-7a通过下调PKM2来抑制非IgA肾炎细胞。
讨论
MiRNA是一种短链的非编码核苷酸RNA，通过直接和间接影响mRNA的转录过程来调节相关基因的表达[6,7]。miRNA在非IgA肾炎发生、发展中，如细胞存活，增殖，凋亡等方面发挥重要作用[8]。
在本研究中，提供了miR-let-7a发挥生理作用的新途径，miR-let-7a特异性结合PKM2mRNA的3'-UTR区，来影响影响非IgA肾炎的细胞增殖、迁移。总之,我们表明了miR-let-7a/PKM2通路在调节非IgA肾炎细胞增殖,凋亡。
参考文献
1.LiuZ,ZhouH,WangW,FuYX,ZhuM.AnoveldendriticcelltargetingHPV16E7syntheticvaccineincombinationwithPD-L1blockadeelicitstherapeuticantitumorimmunityinmice.Oncoimmunology.2016;5:e1147641.
2.LiXL,LiuXX,CaoGS,JuDD,JiangH.NarrowingResectionofParametrialTissuesIsFeasibleinLow-RiskCasesofStageIA2-IB1CervicalCancer.JCancer.2016;7:1481-6.
3.SunL,LiuM,SunGC,YangX,QianQ,FengS,MackeyLV,CoyDH.NotchSignalingActivationinCervicalCancerCellsInducesCellGrowthArrestwiththeInvolvementoftheNuclearReceptorNR4A2.JCancer.2016Jun30;7:1388-95.