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基于CRISPR-Cas12a的水稻中OsmiR827/1850/3982基因突变体创制及分析

2020-12-02阅读(553)

基于CRISPR-Cas12a的水稻中OsmiR827/1850/3982基因突变体创制及分析

论文摘要

MicroRNA（miRNA）是真核生物中一类长度一般为19-24nt,非编码的内源性小分子RNA。它主要通过剪切降解、抑制翻译、以及染色质重塑等方式调控其靶基因mRNA的表达水平。植物miRNA在植物生长发育、表观遗传、应对生物胁迫和非生物胁迫等方面起着至关重要的作用。Os-miR827、Os-miR1850、Os-miR3982分别于2008年、2008年、2011年通过高通量测序获得,其功能研究尚不明确。创制miRNA突变体是研究其生物学功能的重要且有效途径。本研究利用CRISPR-Cas12a系统,构建了分别针对OsmiR827、Os-miR1850、Os-miR3982基因的3个定向编辑载体pCHQ21,pCHQ22,pCHQ23。利用根癌农杆菌介导转化水稻品种日本晴,对获得的T0代水稻植株进行miRNA基因突变体检测,并进一步在T1代中筛选出miRNA基因靶位点纯合突变的稳定遗传水稻突变体材料。并对Os-miR827、Os-miR1850突变体进行了盐胁迫实验。主要研究结果如下:1、针对水稻Os-miR827、Os-miR1850、Os-miR3982基因构建了3个定向编辑载体pCHQ21,pCHQ22,pCHQ23。通过农杆菌介导的遗传转化方法分别获得pCHQ21,pCHQ22,pCHQ23的转基因阳性水稻植株分别为11株,21株和10株。阳性率均为100%,证明了水稻转化系统的高效性。2、利用SSCP和Sanger测序的方法,对T0代中11株pCHQ21植株、20株pCHQ22植株、10株pCHQ23植株基因检测,结果显示pCHQ21、pCHQ23突变率均为100%,pCHQ22突变率为95.2%。其中测序结果显示pCHQ21-01、02、03、07均为双等位基因突变;pCHQ22测序结果显示pCHQ22-01、02、04、21为双等位基因突变,pCHQ22-03、08、10、16为单等位基因突变。;pCHQ23测序结果显示pCHQ23-01、03、05、06均为双等位基因突变。3、对pCHQ21-01、pCHQ21-07、pCHQ21-08、pCHQ22-03、pCHQ22-08、pCHQ23-01和pCHQ23-02株系进行了遗传传递分析,其基因型分离比均为1:2:1,符合孟德尔遗传分离定律,表明突变体能够稳定遗传。4、在盐胁迫实验中,Os-miR827突变体表现与野生型一致。而Os-miR1850突变体表现耐盐胁迫。在对pCHQ22-3-1幼苗盐处理过程中观察发现:在处理第三天时,野生型第二叶叶尖部分局部卷曲变黄,第一小叶完全卷曲成筒状。但是,突变体第二叶叶尖部相对正常,且第一小叶没有出现卷曲。在处理第六天时,野生型整个植株均完全卷曲,颜色偏黄。而突变体相对更为挺立,卷曲不明显。在第三天,第六天对野生型和突变体植株进行株高和根长测量,统计发现二者根长没有明显差别,而株高差别显著。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 绪论
  •   1.1 microRNA在小非编码RNA（ncRNA）中研究的地位
  •     1.1.1 microRNA的生成过程
  •     1.1.2 miRNA两个不同亚类
  •     1.1.3 miRNA在细胞质中的功能
  •     1.1.4 在细胞质中miRNA-RISC的活性
  •   1.2 miRNA在植物中应对生物和非生物胁迫反应时的作用
  •     1.2.1 miRNA在植物胁迫反应中的功能作用
  •     1.2.2 miRNA调控植物病毒和细菌的致病相关机制
  •     1.2.3 应对非生物胁迫时miRNA的表现出的作用
  •   1.3 miRNA在水稻中的研究现状和本研究选择的miRNA研究现状
  •     1.3.1 miRNA在水稻中的研究现状
  •     1.3.2 本研究选择的miRNA研究现状
  •   1.4 突变体创制方法与基因编辑技术
  •   1.5 立体依据及意义
  •   1.6 研究内容
  • 第二章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植物材料
  •     2.1.2 工程菌株
  •   2.2 实验试剂
  •   2.3 实验仪器
  •   2.4 实验方法
  •     2.4.1 水稻CRISPR-Cas12a定向修饰骨架载体构建
  •     2.4.2 crRNA靶位点选择及设计
  •     2.4.3 基因组定向编辑载体构建过程
  •     2.4.4 大肠杆菌DH5α传统热激法转化步骤
  •     2.4.5 菌落PCR
  •     2.4.6 质粒DNA提取及检测验证
  •     2.4.7 农杆菌感受态制备及转化
  •     2.4.8 水稻遗传转化
  •     2.4.9 水稻基因组DNA提取
  •     2.4.10 水稻再生植株转基因阳性检测
  •     2.4.11 水稻基因组向修饰突变体材料PCR-SSCP检测
  •     2.4.12 水稻基因组向修饰突变体材料盐胁迫实验
  •     2.4.13 miRNA基于数据库功能预测和靶基因预测
  • 第三章 结果与分析
  •   3.1 水稻目标基因CRISPR-Cas12a定向修饰表达载体构建
  •   3.2 水稻再生植株转基因阳性鉴定
  •   3.3 水稻miRNAs-T0代植株目的基因突变检测
  •     3.3.1 pCHQ21-T0代植株目的基因检测及测序结果
  •     3.3.2 pCHQ22-T0代植株目的基因检测及测序结果
  •     3.3.3 pCHQ23-T0代植株目的基因检测及测序结果
  •     3.3.4 miRNA-T0代植株目的基因检测结果统计
  •   3.4 水稻miRNA突变体T1代植株目的基因检测和基因型分析
  •     3.4.1 水稻pCHQ21-T1代植株目的基因检测
  •     3.4.2 水稻pCHQ22-T1代植株目的基因检测
  •     3.4.3 水稻pCHQ23-T1代植株目的基因检测
  •   3.5 miRNA突变体-T1代植株基因型检测数据统计
  •   3.6 miRNA突变体-T2代植株苗期表型对比
  •   3.7 miRNA突变体-T2代植株盐胁迫实验
  •   3.8 三个水稻miRNA靶基因预测结果
  •     3.8.1 水稻miRNA827靶基因预测结果
  •     3.8.2 水稻miRNA1850靶基因预测结果
  •     3.8.3 水稻miRNA3982靶基因预测结果
  • 第四章 讨论
  •   4.1 CRISPR-Cas12a创制水稻突变体
  •   4.2 本研究中三个miRNA研究现状和参与调控预测
  •     4.2.1 miRNA827研究现状和参与调控预测
  •     4.2.2 miRNA1850研究现状和参与调控预测
  •     4.2.3 miRNA3982研究现状和参与调控预测
  • 第五章 结论
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻硕期间取得的研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 陈虹樵

    导师: 张勇

    关键词: 突变体,水稻,盐胁迫实验

    来源: 电子科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 电子科技大学

    分类号: S511;Q943.2

    总页数: 59

    文件大小: 2617K

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