Sulfitobacter porphyrae SCM-1（T）对东海原甲藻的杀藻效应及产油能力的影响

论文摘要

东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）是一种单细胞微藻,近年来成为东海多次大型赤潮的主要肇事种之一,几乎每年都在长江口和浙江沿海海域引发大规模的赤潮,其面积之大,世界罕见,大规模的赤潮降低了海洋生物多样性,破坏生态系统的平衡,严重威胁海洋渔业的可持续发展等。鉴于东海原甲藻赤潮的严重危害,急需寻求一种有效可行的防控赤潮的方法。本论文基于“菌藻关系”研究东海原甲藻赤潮的生物防治法。首先从东海原甲藻培养液中分离得到一株具有高效杀藻效果的细菌,并对其进行了形态特征观察、分子鉴定;其次研究了杀藻菌株的生长特性、杀藻特性,并从抗氧化系统、光合作用系统和细胞形态方面研究了杀藻菌株分泌的杀藻组分的杀藻过程和杀藻机理;最后研究了杀藻物质的稳定性和化学极性。此外本文在研究东海原甲藻生长周期过程中发现在细胞生长稳定期具有积累油脂的能力,基于海洋微藻是极具潜力的生物柴油生产藻种,对繁殖速度快、适应能力强的东海原甲藻产油能力的深入研究具有巨大价值,因此对正常培养、缺氮和缺磷胁迫条件下培养的东海原甲藻生长情况、油脂含量及其脂肪酸组成方面也进行了研究分析。主要研究结果如下:（1）从东海原甲藻培养液中分离得到一株具有杀藻效果的菌株SCM-1（T）,通过对该菌株16S rDNA序列进行测序,结合平板菌落形态特征,电子显微镜观察等结果,初步确定菌株SCM-1（T）为亚硫酸杆菌属Sulfitobacterporphyrae。（2）菌株SCM-1（T）主要通过分泌活性物质进行间接杀藻,且5%SCM-1（T）菌培养液上清处理72 h后,杀藻效果可达到96.96%;菌株SCM-1（T）作用于东海原甲藻,对藻细胞内活性氧和氧自由基产生起了促进作用,短时间内2 h、4 h和6h活性氧含量显著升高,分别为对照组的2.33、4.18和3.35倍。同时抗氧化系统中的SOD、POD、CAT和GSH的活性上升启动应激作用清除过量的ROS,但是短期内的过量ROS已经造成了光合系统和膜系统的损伤。（3）东海原甲藻在SCM-1（T）菌培养液上清的胁迫下,藻细胞的叶绿素a含量处理72 h后下降至对照组的19%,且最大光合量子产量Fv/Fm和电子传递速率（rETR）在处理4h显著下降,Fv/Fm的值近为对照组的59%,说明藻细胞受到过量ROS的攻击后光合膜系统等结构受到损伤。（4）荧光显微镜观察藻细胞核区的变化发现,随着处理时间的延长,藻细胞核的形态由开始的紧密成团演变成扩散现象甚至最后完全降解;基于透射电镜和扫描电镜观察藻细胞结构表明,受到杀藻上清处理的藻细胞48 h后细胞膜和细胞壁破裂严重,细胞器受到破坏、内容物释放;处理至72 h后仅剩空壳,细胞死亡,该死亡过程类似真核细胞的坏死。（5）菌株SCM-1（T）分泌的活性物质具有良好的热稳定性、光稳定性和酸碱稳定性,说明杀藻活性物质不属于多肽类和核酸类物质;经不同极性的有机试剂萃取杀藻活性物质,发现正丁醇萃取所得物处理藻细胞48 h的杀藻率高达93.6%,说明该活性物质属于强极性成分。（6）正常培养的东海原甲藻在对数生长期开始积累生产油脂的原料,进入生长稳定期细胞数超过2.803×105个/mL,单位藻细胞油脂含量增加8.5倍,油脂含量占细胞干重的20.0%,同时尼罗红染色后显微观察到脂滴随时间的延长而不断积累,证明正常培养的东海原甲藻具有高效生产油脂的能力。（7）研究发现氮、磷胁迫抑制了藻细胞生长但是促进油脂合成,缺氮培养18天时藻细胞密度为1.06×105个/mL,相比对照组下降了70%,单位藻细胞油脂荧光强度为对照组1.34倍;缺磷培养的藻细胞密度为3.2×104个/mL,仅为对照组的1/10,而单位藻细胞油脂的荧光强度最高,为正常培养细胞的2.2倍。（8）脂肪酸成分分析表明正常培养条件下藻细胞产生的脂肪酸成分种类多,包括多种饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸,主要以棕榈酸C16:0、C18:4n3、C18:5n3和C22:6（DHA）为主,分别占28.26%、9.38%、27.08%和9.36%;在缺氮、缺磷培养条件下细胞油脂代谢产生的C16:0和C22:6显著升高,分别提升至33.96%、16.55%和33.6%、20.32%,而C18:4n3和C18:5n3的占比分别下降至4.87%、14.02%和6.04%、1 6.65%。（9）杀藻菌株SCM-1（T）处理东海原甲藻后油脂总量无明显变化,其中C18:0、C18:1和C18:2的占比分别增加了 7.7%、12.45%和1.58%,表明可通过细菌裂解法采收藻细胞油脂。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1 赤潮的形成及危害
•     1.1 赤潮的形成
•     1.2 赤潮的危害
•   2 国内外赤潮的治理概述
•   3 溶藻细菌及其溶藻活性物质的研究概况
•     3.1 溶藻细菌种类
•     3.2 溶藻细菌的作用方式
•     3.3 杀藻活性物质
•   4 藻细胞死亡机制的研究
•   5 微藻生物柴油的发展
•     5.1 产油微藻的种类
•     5.2 国内外微藻生物柴油的研究进展
•   6 微藻油脂含量的影响因素
•     6.1 培养基中的营养元素
•     6.2 产油微藻的培养条件
•     6.3 产油微藻的培养方式
•   7 本论文研究内容及意义
•     7.1 研究内容
•     7.2 本论文研究意义
•     7.3 研究的技术路线
• 第二章 高效杀藻菌株的分离及其杀藻特性研究
•   1 实验材料和主要仪器
•     1.1 实验藻种
•     1.2 实验主要的培养基
•     1.3 实验所需试剂
•     1.4 实验所需溶液和试剂盒
•     1.5 实验所需仪器
•   2 实验方法
•     2.1 杀藻菌株的分离筛选与鉴定
•     2.2 杀藻菌SCM-1（T）杀藻特性的研究
•     2.3 亚硫酸杆菌SCM-1（T）对东海原甲藻细胞核区的影响
•     2.4 亚硫酸杆菌SCM-1（T）对东海原甲藻抗氧化系统的影响
•     2.5 亚硫酸杆菌SCM-1（T）对东海原甲藻细胞光合系统的影响
•     2.6 杀藻菌SCM-1（T）处理东海原甲藻后扫描电子显微镜观察超显微结构的变化（SEM）
•     2.7 杀藻菌SCM-1（T）处理东海原甲藻后超显微结构的观察（TEM）
•     2.8 亚硫酸杆菌SCM-1（T）杀藻谱的确定
•   3 实验结果
•     3.1 杀藻菌株的分子鉴定和系统计划树的构建
•     3.2 亚硫酸杆菌SCM-1（T）的形态观察
•     3.3 亚硫酸杆菌SCM-1（T）的杀藻特性研究
•     3.4 菌株SCM-1（T）对东海原甲藻细胞核区的影响
•     3.5 菌株SCM-1（T）杀藻上清对东海原甲藻细胞生理功能的影响
•     3.6 菌株SCM-1（T）胁迫下东海原甲藻细胞光合系统的响应
•     3.7 菌株SCM-1（T）杀藻上清处理下SEM和TEM观察藻细胞形态的变化
•     3.8 菌株SCM-1（T）杀藻上清杀藻谱
•   4 讨论
•   5 小结
• 第三章 海洋亚硫酸杆菌SCM-1（T）活性代谢产物特性研究
•   1 实验材料和主要仪器
•     1.1 实验藻种
•     1.2 实验主要的培养基
•     1.3 实验所需试剂
•     1.4 实验所需仪器
•   2 实验方法
•     2.1 亚硫酸杆菌SCM-1（T）菌培养液上清热稳定性
•     2.2 亚硫酸杆菌SCM-1（T）菌培养液上清光稳定性研究
•     2.3 亚硫酸杆菌SCM-1（T）菌培养液上清酸碱稳定性研究
•     2.4 无菌滤液NaOH沉淀后杀藻研究
•     2.5 杀藻活性物质化学极性分析
•   3 实验结果
•     3.1 温度对菌培养液上清杀藻效果的影响
•     3.2 光照时间对菌培养液上清杀藻效果的影响
•     3.3 pH对菌培养液上清杀藻效果的影响
•     3.4 NaOH沉淀后菌培养液上清的杀藻效果
•     3.5 杀藻活性物质化学极性
•   4 讨论
•   5 小结
• 第四章 氮、磷对东海原甲藻的生长与油脂积累的影响
•   1 实验材料和主要仪器
•     1.1 实验藻种
•     1.2 实验主要的培养基
•     1.3 实验所需试剂
•     1.4 实验所需溶液
•     1.5 实验所需仪器
•   2 实验方法
•     2.1 正常培养下东海原甲藻细胞密度的测定
•     2.2 正常培养下东海原甲藻油脂积累检测
•     2.3 氮、磷胁迫培养下东海原甲藻细胞密度的测定
•     2.4 氮、磷胁迫培养下东海原甲藻油脂积累检测
•     2.5 氮、磷胁迫对藻细胞光合系统的影响
•     2.6 油脂含量的测定和脂肪酸成分分析
•     2.7 亚硫酸杆菌SCM-1（T）处理东海原甲藻后细胞油脂含量和脂肪酸成分分析
•   3 实验结果
•     3.1 东海原甲藻正常培养条件下细胞生长曲线及油脂含量变化
•     3.2 氮、磷胁迫条件下藻细胞生物量及油脂含量的变化
•     3.3 氮、磷胁迫条件对藻细胞光合系统的影响
•     3.4 氮、磷胁迫条件下东海原甲藻胞内外油脂比分
•     3.5 氮、磷胁迫条件下东海原甲藻脂肪酸成分分析
•     3.6 菌株SCM-1（T）杀藻上清对东海原甲藻的油脂含量及脂肪酸成分的影响
•   4 讨论
•   5 小结
• 第五章 结论与展望
•   1 论文的主要结论
•   2 论文的主要创新点
•   3 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张福星

导师: 徐虹

关键词: 赤潮,东海原甲藻,亚硫酸杆菌属,杀藻机制,产油能力

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q949.9

总页数: 114

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