论文摘要
植物不断受到周围环境信号的影响,它们必须将这些信号整合到其生长发育等调控中,以适应不断变化的环境。植物同样也受到一系列激素和多肽等小分子的精确调控,他们彼此在微妙的平衡中起共同调节作用。植物激素ABA在这些反应中起着非常重要的作用。在干旱或盐胁迫条件下,植物体内的ABA含量增加,ABA含量的增加能诱导保卫细胞的关闭和渗透相容溶质的积累以及逆境响应基因的表达,从而增强了植物应对逆境胁迫下的响应能力。鉴于ABA在植物应答环境逆境响应的重要性,理解激素与其靶向应答的信号转导机制一直是非生物逆境研究的焦点。ABI2型PP2C磷酸酶是ABA信号响应中的核心调节因子,能够抑制SnRK2s的激酶活性,导致ABA信号通路的失活。本实验室前期的研究发现通过FER-GEF1/4/10-ROP11-ABI2途径激活ABI2的磷酸酶活性介导对ABA信号通路的抑制。然而ABA信号通路是通过怎样的方式介导对FER信号通路的调控,两者进行交叉会话共同调控植物的生长发育以及逆境响的分子机制目前还并不清楚。2014年Sussman课题组发现FER能够结合一种被称为快速碱化因子（RALF1）的多肽配体激活FER的激酶活性从而抑制质膜H+泵AHA2介导的酸化,导致根生长的抑制。而ABA信号通路则通过ABA结合其受体从而抑制PP2CAs的磷酸酶活性,导致SnRK2s活性的释放,激酶活性的SnRK2s能直接抑制质膜H+泵AHA2介导的酸化导致根生长的抑制。基于此,本论文想进一步研究RALF1和ABA信号通路之间是如何共同介导对根生长的抑制,研究RALF1和ABA信号通路之间交叉会话的节点,初步探索RALF1与ABA信号通路相互作用应答逆境响应的分子机制。本论文依据此研究思路开展了一系列的分子、生化与遗传学等实验,论文的具体研究结果如下:（1）利用大肠杆菌原核表达系统高效表达了融合GST标签的FER1-446aa重组蛋白GST-FER1-446 aa,利用纯化的GST-FER1-446 aa重组蛋白作为抗原免疫大白兔制备了FER多克隆抗体。利用蛋白迁移结合Western blot的方法,通过体内磷酸化和体外磷酸化实验,发现RALF1和ABA均能使FER发生磷酸化,实验结果表明FER均能响应RALF1和ABA信号;（2）通过对fer突变体遗传学材料进行冷、热、高盐、高渗透压等非生物逆境胁迫处理,发现FER能调控非生物逆境响应。fer突变体对冷、热和高盐逆境超敏感,对高渗透胁迫不敏感;（3）通过对ABI2功能获得性遗传学材料的研究,发现ABI2能部分恢复fer突变体对ABA和高盐逆境超敏感的应答（气孔开度和根长长度表型分析实验）,说明功能获得性的abi2-1突变体补偿了fer突变体在ABA反应中的功能缺失;（4）通过酵母双杂交（Y2H）、GST pull-down、Co-IP、双荧光互补（BiFC）等多种分析蛋白相互作用的技术手段证明了ABI2能与FER受体蛋白激酶特异性的相互作用,并且ABI2与FER相互作用抑制FER的激酶活性;（5）通过体外重建ABA/PYL1/ABI2/FER信号通路,发现ABA促进FER的磷酸化是通过ABA-PYR/PYL/RCAR-PP2CAs信号抑制ABI2的磷酸酶活性,导致ABI2对FER激酶活性抑制的解除引起;（6）通过对abi2-1功能获得性突变体以及RALF1-RNAi/ralf1（ralf1）的根长抑制分析实验和RALF1和ABA剂量响应分析,初步发现ABA促进RALF1对根长抑制,RALF1降低ABA对拟南芥主根的抑制;（7）建立了ABA与RALF1信号通路通过FER与ABI2相互作用进行交叉会话的工作模型:ABA通过激活SnRK2s直接抑制AHA2。RALF1-FER通路通过抑制AHA2活性抑制细胞生长,RALF1-FER通过激活GEF1/4/10-ROP11通路激活ABI2磷酸酶,从而抑制ABA反应。同时,ABI2与FER相互作用并使FER去磷酸化,抑制FER-GEF1/4/10-ROP11通路。综上所述,本研究结果发现植物可以通过FER与ABI2之间的相互作用介导ABA与RALF1信号的交叉会话共同调控植物的生长和逆境响应。
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摘要Abstract第1章 绪论 1.1 配-受体特异性识别介导对植物生长调控的研究进展 1.2 植物激素信号转导途径概述 1.2.1 脱落酸（Abscisic Acid）信号转导途径 1.2.2 乙烯（Ethylene）信号转导途径 1.2.3 油菜素内酯（Brassinosteroid）信号转导途径 1.2.4 生长素（Auxin）信号转导途径 1.2.5 细胞分裂素（Cytokinin）信号转导途径 1.2.6 赤霉素（Gibberellin）信号转导途径 1.2.7 茉莉酸（Jasmonic Acid）信号转导途径 1.2.8 独脚金内酯（Strigolactone）信号转导途径 1.3 植物受体蛋白激酶（RLK）的概述 1.3.1 RLK的发现及研究进展 1.3.2 FERONIA（FER）及其同源家族在植物生长发育中的功能研究进展 1.4 RALF1及其同源家族在植物生长发育中的功能研究进展 1.5 其他内源激素类多肽与其受体在植物生长发育及生理中的功能研究进展 1.6 本论文的研究目的与意义第2章 实验材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料与菌种 2.1.2 质粒载体 2.1.3 抗体 2.1.4 药品与试剂 2.1.5 仪器与设备 2.1.6 试剂配制 2.2 实验方法 2.2.1 基因克隆及载体构建 2.2.2 FER内源多克隆抗体的制备和特异性分析 2.2.3 ABI2内源多克隆抗体的制备和特异性分析 2.2.4 GST融合蛋白的原核表达与纯化 2.2.5 His融合蛋白的原核表达与纯化 2.2.6 RALF1小肽的制备及活性分析 2.2.7 RALF1诱导的FERONIA体内磷酸化分析 2.2.8 ABA诱导的FERONIA体内磷酸化分析 2.2.9 碱性磷酸酶（CIP）实验 2.2.10 拟南芥逆境响应的表型分析 2.2.11 拟南芥表皮细胞气孔开度测定 2.2.12 拟南芥RNA的提取及RT-PCR 2.2.13 酵母双杂交验证FER相互作用蛋白 2.2.14 Pull-down验证蛋白相互作用 2.2.15 氯化铯密度梯度离心大提质粒 2.2.16 拟南芥原生质体转化及双分子荧光互补（BiFC）实验 2.2.17 免疫共沉淀分析 2.2.18 PYL1（ABA）-ABI2-FER体外重建实验分析第3章 RALF1和ABA促进拟南芥受体蛋白激酶FER的磷酸化 3.1 实验材料和方法 3.2 实验结果与分析 3.2.1 FER多克隆抗体的制备和特异性检测 3.2.2 RALF1小肽的活性检测 3.2.3 RALF1促进FER的磷酸化 3.2.4 ABA促进FER的磷酸化 3.3 小结第4章 拟南芥受体蛋白激酶FER参与调控非生物逆境响应 4.1 实验材料和方法 4.2 实验结果与分析 4.2.1 fer-4突变体对高浓度NaCl超敏感 4.2.2 fer-4突变体对渗透胁迫的敏感性较低 4.2.3 fer-4突变体对冷胁迫超敏感 4.2.4 fer-4突变体对热胁迫超敏感 4.2.5 abi2-1突变体降低fer突变体的ABA超敏感表型 4.2.6 abi2-1突变体降低fer突变体的NaCl超敏感表型 4.3 小结第5章 拟南芥受体蛋白激酶FER与蛋白磷酸酶ABI2相互作用 5.1 实验材料和方法 5.2 实验结果与分析 5.2.1 FER胞内激酶结构域与ABI2在酵母系统中存在相互作用 5.2.2 FER胞内激酶结构域与ABI2同源家族成员在酵母系统中存在相互作用 5.2.3 FER与ABI2在体外存在相互作用 5.2.4 FER与ABI2在体内存在相互作用 5.2.5 FER与ABI2在细胞膜上存在相互作用 5.3 小结第6章 RALF1与ABA信号通路通过FER与ABI2相互作用共同调控细胞生长 6.1 实验材料和方法 6.2 实验结果与分析 6.2.1 ABI2抑制FER的磷酸化 6.2.2 ABA通过PYR/PYL/RCAR-PP2Cs通路促进FER的磷酸化 6.2.3 ABA促进RALF1对拟南芥主根的抑制 6.2.4 RALF1降低ABA对拟南芥主根的抑制 6.2.5 ralf1突变体对ABA超敏感 6.3 小结第7章 讨论与展望 7.1 讨论 7.1.1 ABI2与FER相互作用介导ABA和RALF1信号对植物细胞生长的共同调控 7.1.2 结论与创新 7.2 工作展望参考文献附录 引物个人简历及在学期间发表和完成的学术论文与研究成果致谢
文章来源
类型: 博士论文
作者: 陈佳
导师: 刘选明
关键词: 拟南芥,多肽,交叉会话
来源: 湖南大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,化学
单位: 湖南大学
分类号: Q55;O641.3
DOI: 10.27135/d.cnki.ghudu.2019.003550
总页数: 115
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标签：拟南芥论文; 多肽论文; 交叉会话论文;
拟南芥受体激酶FERONIA与磷酸酶ABI2相互作用介导ABA与RALF1信号交叉会话机制
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