新城疫病毒F蛋白在293T细胞系中的稳定表达及其活性研究

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的急性高致病性病毒性传染病,是危害养鸡业最主要的疫病之一。疫苗免疫是世界各主要养禽国家用于预防和控制新城疫流行和发生的最主要措施,也是最经济最有效的技术手段。目前,商品化的疫苗,无论是灭活疫苗还是活疫苗均具有良好的免疫效果,但其生产基质为鸡胚,生产成本高,且鸡胚的无害化处理过程会增加一定的生物安全风险和环保压力。随着分子生物学技术的发展,采用哺乳动物细胞系表达特定蛋白而制备的治疗性活性生物物质或基因工程亚单位疫苗已取得了很大的进展,有许多产品已商品化,因此也成为当前兽用疫苗研究的热点。本研究拟使用293T细胞系表达新城疫主要保护性抗原F蛋白,探索性研制新城疫亚单位疫苗,为新城疫新型疫苗研发提供一种新的研究路径。首先,本研究将NDV LaSota株F基因插入到携带绿色荧光基因的慢病毒载体pHB中,构建pHB-F转移载体。利用脂质体将包装慢病毒的三种质粒pHB-F、pX、pG共同转染293T细胞,收获包装成功的慢病毒,然后再利用包装的慢病毒感染293T细胞,最后采用有限稀释法筛选出含绿色荧光的单克隆阳性细胞并进行扩大培养,获得F-293T细胞系。将构建的F-293T细胞进行连续传代,发现不同代次细胞的荧光强度未发现明显差异,同时对不同代次细胞进行RT-PCR检测,均能检测到特异性条带,表明F基因能在293T细胞中稳定遗传;对细胞培养上清进行SDS-PAGE和Western-Blot验证,能检测到F蛋白特异目的条带。上述研究结果表明,已成功构建了能够稳定表达NDV F蛋白的F-293T细胞系。其次,为了进一步证实F-293T细胞表达的F蛋白的免疫活性,将收集的含F蛋白的细胞上清经初步浓缩纯化后,用矿物油佐剂乳化制备成疫苗免疫25日龄SPF鸡。免疫后不同时间采血并分离血清,经鸡胚中和试验评价血清抗体产生情况。试验结果表明,免疫鸡血清能够特异性中和新城疫病毒LaSota株,说明表达的F蛋白免疫鸡可以产生特异性的新城疫保护性抗体,该免疫试验结果也进一步证明了本研究所构建的表达NDV F蛋白的F-293T细胞可表达具有免疫活性的F蛋白。因此,通过本论文研究,我们成功构建了稳定表达NDV F蛋白的F-293T细胞株,为进一步开展F蛋白的结构和功能研究,NDV亚单位疫苗的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 引言
•   1.1 新城疫
•     1.1.1 研究概述
•     1.1.2 流行病学
•     1.1.3 临床症状
•     1.1.4 病理变化
•     1.1.5 诊断方法
•     1.1.6 防控手段
•     1.1.7 ND疫苗研究进展
•   1.2 新城疫病毒
•     1.2.1 分类和形态
•     1.2.2 生物学特性
•     1.2.3 理化特性
•     1.2.4 培养特性
•     1.2.5 基因组结构
•     1.2.6 NP蛋白
•     1.2.7 P蛋白
•     1.2.8 M蛋白
•     1.2.9 F蛋白
•     1.2.10 HN蛋白
•     1.2.11 L蛋白
•   1.3 慢病毒载体系统
•     1.3.1 慢病毒载体系统的建立
•     1.3.2 慢病毒载体系统的应用
•   1.4 目的和意义
• 第二章 稳定表达F蛋白的F-293T细胞系的构建
•   2.1 引言
•   2.2 材料
•     2.2.1 载体、毒株和细胞
•     2.2.2 主要试剂
•   2.3 仪器设备
•   2.4 方法
•     2.4.1 新城疫病毒RNA提取
•     2.4.2 反转录
•     2.4.3 T载体的构建
•     2.4.4 转移载体的构建
•     2.4.5 包装质粒、包膜质粒抽提
•     2.4.6 293T细胞的培养、传代及冻存
•     2.4.7 细胞转染
•     2.4.8 慢病毒感染
•     2.4.9 细胞的筛选和扩大培养
•     2.4.10 RT-PCR鉴定
•     2.4.11 SDS-PAGE电泳
•     2.4.12 Western Blot
•   2.5 结果
•     2.5.1 pT-F载体的构建
•     2.5.2 转移载体pHB-F的构建
•     2.5.3 包装质粒、包膜质粒的提取
•     2.5.4 细胞转染
•     2.5.5 慢病毒感染
•     2.5.6 阳性细胞克隆
•     2.5.7 细胞稳定性检测
•     2.5.8 SDS-PAGE
•     2.5.9 Western Blot鉴定
•   2.6 讨论与小结
•     2.6.1 病毒感染的影响因素
•     2.6.2 影响蛋白表达量的因素
•     2.6.3 F蛋白反应原性检测
• 第三章 F蛋白免疫原性的检测
•   3.1 引言
•   3.2 材料
•     3.2.1 SPF鸡（胚）、毒株、血清和细胞
•     3.2.2 主要试剂
•   3.3 仪器设备
•   3.4 方法
•     3.4.1 蛋白提取
•     3.4.2 免疫接种
•     3.4.3 1%鸡红细胞悬液的配置
•     3.4.4 NDV EID50的测定
•     3.4.5 中和试验
•   3.5 结果
•     3.5.1 F蛋白检测
•     3.5.2 LaSota株EID50的测定
•     3.5.3 鸡胚中和试验
•   3.6 讨论与小结
•     3.6.1 细胞上清中F蛋白的浓缩和纯化
•     3.6.2 F蛋白免疫活性检测
• 第四章 结论
• 第五章 创新点
• 参考文献
• 附录 溶液及配制方法
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 倪志远

导师: 蒋桃珍

关键词: 新城疫病毒,蛋白,慢病毒载体,反应原性,免疫原性

来源: 中国兽医药品监察所

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国兽医药品监察所

基金: 国家重点研发计划编号:2017YFD0500704

分类号: S852.65

总页数: 64

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