HPLC法检测雷公藤悬浮细胞中雷酚内酯的含量研究

HPLC法检测雷公藤悬浮细胞中雷酚内酯的含量研究

叶龙飞1,2张景红1,2

(1华侨大学生物医学学院福建泉州362021)

(2华侨大学分子药物教育部工程研究中心福建泉州362021)

【摘要】采用梯度洗脱的方法,建立了雷公藤悬浮细胞体系中雷酚内酯的定量检测方法,并考察了MeJA对雷公藤悬浮细胞体系中雷酚内酯含量的作用。

【关键词】雷公藤悬浮细胞雷酚内酯高效液相色谱

【中图分类号】R44【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2014)10-0141-02

高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography/HPLC)是一种具有高效、低廉,操作简便等优点的一种检测方法,广泛运用于天然药物的提取、分离和测定研究[1-3]。我们课题组成功从雷公藤悬浮细胞中分离得到雷酚内酯,但是以前的研究中,由于雷酚内酯在雷公藤中含量极少,目前的研究尚未建立稳定的HPLC检测方法,加之雷公藤悬浮细胞体系分离比较复杂。缺乏雷酚内酯的定量分析方法。为此,本文从雷公藤悬浮细胞体系中分离得到雷酚内酯,建立了雷酚内酯HPLC检测方法。得到了满意的检测效果。现报道如下:

1实验材料和方法

1.1药品和试剂

雷酚内酯对照品(纯度>98%,由本实验室自主制备获得)

1.2仪器与方法

1.2.1仪器

高效液相色谱仪Agilent1200型,美国Agilent公司

色谱柱:HypersilODS2-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)

1.2.2色谱分离方法

表1雷酚内酯HPLC梯度条件

图3雷酚内酯标准品的标准曲线

以峰面积平均值(Y)为纵坐标,以浓度(X)为横坐标进行线性回归(见图3),得回归方程y=118.83x+174.18R2=0.9988。表明雷酚新内酯标准品溶液在1.5-96μg/mL的范围内具有良好的线性关系。最低检测限为0.13μg/mL。

2.3日内精密度

以6.0、24.0、96.0μg/mL雷公藤甲素标准品溶液为测定需要的低、中、高三个浓度溶液,于ld内每隔4小时重复测定5次,并计算RSD值和RE值,结果见表3所示。

表3日内精密度考察

标准品浓度(μg/mL)日内精密度(n=5)

测得浓度(平均值-x±SD,μg/mL)精密度

(RSD%)准确性(RE%)

6.05.78±1.460.196.9

24.024.00±1.440.162.4

96.093.00±1.200.371.9

由表3可以得出6.0、24.0、96.0μg/mL三个浓度的雷公藤甲素标准品溶液在1d内的RSD值分别为0.19%、0.16%和0.37%,RE值分别为6.9%、2.4%和1.9%,表明日内精密度良好。

2.4日间精密度

以6.0、24.0、96.0μg/mL雷公藤甲素标准品溶液为测定需要的低、中、高三个浓度溶液,分别于制备后0、1、3、5、7d测定其峰面积,并计算RSD值RE值,结果见表4所示。

表4日间精密度考察

标准品浓度(μg/mL)日间精密度(n=5)

测得浓度(平均值-x±SD,μg/mL)精密度(RSD%)准确性

(RE%)

6.05.78±1.460.137.0

24.024.02±1.440.252.4

96.093.85±1.420.071.0

由表4可以得出6.0、24.0、96.0μg/mL三个浓度的雷公藤甲素标准品溶液在7d内的RSD值分别为0.13%、0.25%和0.07%,RE值分别为7.0%、2.4%和1.0%,表明日间精密度良好。

2.5稳定性

以6.0、24.0、96.0μg/mL雷公藤甲素标准品溶液为测定需要的低、中、高三个浓度溶液,分别于25℃下放置24h和4℃下放置28d后测定其峰面积,并计算RSD值和RE值,结果见表5和表6和所示。

表525℃稳定性考察

标准品浓度(μg/mL)日内精密度(n=3)

测得浓度(平均值-x±SD,μg/mL)精密度(RSD%)准确性

(RE%)

6.05.81±1.460.227.3

24.023.94±1.450.092.8

96.093.94±1.420.110.3

表64℃稳定性考察

标准品浓度(μg/mL)日内精密度(n=3)

测得浓度(平均值-x±SD,μg/mL)精密度(RSD%)准确性(RE%)

6.05.79±1.460.156.9

24.023.94±1.450.142.7

96.093.92±1.430.070.9

由表5和表6可以看出雷公藤甲素标准品溶液在25℃和4℃下分别放置24h和4周,峰面积RSD值和RE值均符合要求,表明雷公藤甲素在25℃和4℃下性质稳定。

2.6加样回收率

取9份已知TP浓度的样品溶液9份,分别加入雷公藤甲素标准品1.5、12.0、48.0μg/mL各3份,按方法3.3.1色谱条件进行检测,根据峰面积计算出浓度,并计算出回收率和RSD值。所得结果见表7所示。

表7加样回收率考察(n=3)

加入浓度(μg/mL)检测浓度(μg/mL)回收率(%)RSD(%)

6.05.81±1.4596.8±0.240.32

24.023.78±1.4099.1±0.060.45

96.094.87±1.2598.8±0.010.41

由表7可知,低、中、高三个浓度的平均回收率分别为为96.8%、99.1%、98.8%,RSD值均低于5%。

3悬浮细胞中雷酚内酯含量分析

茉莉酸甲酯(MeJA)是茉莉属素馨花中香精油的有气味化合物,也是茉莉花中特殊香味的重要组成成分。研究发现茉莉酸甲酯作为基因调控的诱导子或激活子,可上调或下调许多植物次生代谢物质基因的表达,是调控植物次生代谢物合成的重要激素[4]。

图4MeJA处理前后雷公藤悬浮细胞中雷酚内酯的含量分析

由图4可见,50μM茉莉酸甲酯诱导下培养液中雷酚内酯含量在加药后第5天含量达到最大,为0.169mg/L培养液,是对照组的193.6倍,达到了明显的诱导调控效果。

如果用HPLC法等度洗脱(流动相比例保持不变)检测雷公藤次生代谢产物的情况,产物之间不容易分开,峰与峰之间会交叉或重叠在一起,分离度差,塔板理论数低,不易于进行分析。故本文摸索出使用梯度洗脱的方法来检测雷公藤悬浮细胞体系中雷酚内酯含量的变化,该方法使多个次生产物之间分离度良好,且稳定、可靠、重现性好,为此后的分析鉴定奠定基础。

4结论

本论文成功建立了HPLC梯度洗脱的检测方法测定雷酚内酯的含量[5-6],该方法灵敏度高、准确度高、重复性佳,在25℃和4℃的条件下样品性质稳定。

参考文献

[1]李琰,雷公藤组织培养生产次生代谢产物及其代谢调控研究:[博士学位论文].杨凌:西北农林科技大学,2008.

[2]陈玉,杨光忠,李援朝.雷公藤化学成分的研究.天然产物研究与开发,2005,17(3):301~302.

[3]张聪聪,黄建明,俞媚华,等.HPLC法测定雷公藤提取物中雷公藤甲素及两种生物碱的含量.复旦学报(医学版)2009,5(36)3:333~335.

[4]王学勇,崔光红,黄璐琦,等.茉莉酸甲酯对丹参毛状根中丹参酮类成分积累和释放的影响.中国中药杂志,2007,32(4):300-302.

[5]王金海,张景红.雷公藤甲素及其衍生物组合物的制备方法.[中国专利].201310067482.8.2013.

[6]谢深霞,叶龙飞,张景红.一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用.[中国专利].201310597163.2.2013.

【基金项目】国家自然科学基金资助项目(81173503);福建省自然科学基金投资项目(2012J01398);国家自然科学基金培育计划专项资助.

标签:;  ;  ;  

HPLC法检测雷公藤悬浮细胞中雷酚内酯的含量研究
下载Doc文档

猜你喜欢