果蝇和家蚕中ELAV RNA结合蛋白家族的研究

论文摘要

在多细胞生物中,转录、转录后和翻译水平的调控在基因表达过程中具有重要作用。RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）是一类重要的转录及转录后调控因子,主要通过一个或多个RNA结合区域,与单链或双链RNA结合,参与基因表达的多种调控过程。ELAV/Hu是一类含有3个RRMs、高度保守的神经细胞RNA结合蛋白家族。双翅目昆虫果蝇中,该蛋白家族包括ELAV、RBP9和FNE,其中ELAV主要参与神经系统的发育分化,调控神经系统中靶标基因的选择性剪接;而RBP9和FNE研究较少,且二者在神经系统中的功能尚未明确。本文将以FNE和RBP9为研究对象,探究两者的互作蛋白,初步揭示二者在果蝇生长发育中的分子生物学功能。主要研究内容和结果如下:前期本课题组利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,分别在rbp9和fne基因前敲入3×Flag和V5融合蛋白标签序列,成功获得V5-FNE和3×Flag-RBP9转基因果蝇品系。同时利用果蝇遗传杂交实验,构建了V5FNE-3×FlagRBP9果蝇品系。首先,以这三个果蝇品系的头部为实验材料,利用免疫沉淀技术检测到RBP9与FNE在蛋白质水平上存在相互作用,这与之前利用果蝇杂交实验检测到的二者互作相一致,表明RBP9与FNE的相互作用在果蝇生长发育中具有重要的意义。其次,通过pull down实验方法纯化富集RBP9,对纯化产物进行质谱检测,鉴定与RBP9互作的蛋白。经分析,鉴定得到190个特异与RBP9可能存有相互作用的蛋白质。经GO分析,发现这些蛋白质主要参与了核小体、染色质组装、线粒体合成等生物学过程;KEGG富集分析显示,这些互作蛋白主要参与碳代谢、核糖体、柠檬酸循环（TCA循环）和氨基酸的生物合成等通路。由此推测RBP9通过与这些蛋白质相互作用,在基因转录、转录后调控、翻译等过程起着重要的调控作用。最后,以果蝇中FNE氨基酸序列在NCBI中进行BLAST,在家蚕数据库中找到2个同源基因,分别为Bmel-1和Bmel-2,其编码的蛋白质均含有3个RRMs。利用RT-PCR检测2个基因在家蚕品系p50不同组织不同时期表达谱,结果显示Bmel-1和Bmel-2在五龄第3天的头部、精巢和卵巢中表达水平较高;二者在胚胎期表达相似,呈现不断上升的趋势,在胚胎后期达到最高值;在蚁蚕到四龄眠的幼虫期,Bmel-1表达水平较平稳,在四龄起表达量减弱,Bmel-2呈现明显的下降趋势;在蛹期和成虫阶段,Bmel-2表达量较低,Bmel-1在雌、雄蛹和成虫均有较稳定表达水平。研究结果为后续解析ELAV蛋白家族在家蚕生长发育等过程中的生物学功能奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 第1章 绪论
•   1.1 RNA结合蛋白
•   1.2 ELAV/Hu RNA结合蛋白家族
•     1.2.1 哺乳动物中ELAV/Hu蛋白家族
•     1.2.2 果蝇中ELAV/ Hu RNA结合蛋白家族
•     1.2.3 ELAV/Hu蛋白家族与疾病
•   1.3 家蚕中含有RRM结构域的RNA结合蛋白
•   1.4 本文研究内容
• 第2章 果蝇神经系统中FNE与 RBP9 相互作用的研究
•   2.1 引言
•   2.2 实验材料与试剂
•     2.2.1 实验材料
•     2.2.2 常用试剂和缓冲液的配置
•     2.2.3 主要实验仪器和设备
•     2.2.4 生物信息学分析网站
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术构建V5-FNE和3×Flag-RBP9 果蝇品系
•     2.3.2 构建V5FNE-3×FlagRBP9 果蝇品系
•     2.3.3 果蝇基因组的提取
•     2.3.4 常规PCR反应
•     2.3.5 果蝇头部组织蛋白提取
•     2.3.6 目的蛋白免疫共沉淀
•     2.3.7 SDS-PAGE电泳及Western blot检测
•   2.4 结果与分析
•     2.4.1 获得3×Flag-RBP9 转基因果蝇品系
•     2.4.2 获得V5FNE-3×FlagRBP9 纯合果蝇品系
•     2.4.3 FNE与 RBP9 在蛋白质水平上存在直接相互作
•   2.5 讨论
•     2.5.1 构建转基因果蝇品系
•     2.5.2 构建V5FNE-3×FlagRBP9 果蝇品系
•     2.5.3 FNE和 RBP9 相互作用的研究
•   2.6 本章小结
• 第3章 RBP9 互作蛋白的研究
•   3.1 引言
•   3.2 实验材料与方法
•     3.2.1 果蝇品种
•     3.2.2 实验试剂
•     3.2.3 常用试剂和缓冲液的配置
•     3.2.4 生物信息学分析软件
•     3.2.5 实验方法
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 果蝇神经系统RBP9 纯化检测
•     3.3.2 质谱检测分析
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 第4章 家蚕中ELAV-like RNA结合蛋白家族表达谱的研究
•   4.1 引言
•   4.2 实验材料与设备
•     4.2.1 实验材料
•     4.2.2 生物信息学分析软件
•     4.2.3 主要实验仪器和设备
•   4.3 实验方法
•     4.3.1 常用PCR和 qRT-PCR体系及程序
•     4.3.2 RNA提取
•     4.3.3 反转录
•   4.4 结果与分析
•     4.4.1 家蚕Bmelav-like基因
•     4.4.2 Bmel-1、Bmel-2 基因组织和时期表达谱分析
•   4.5 讨论
•     4.5.1 Bmel-1、Bmel-2 在家蚕不同组织中的表达情况
•     4.5.2 Bmel-1、Bmel-2 在家蚕不同时期的表达情况
•   4.6 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 顾佳蕙

导师: 汪生鹏

关键词: 蛋白家族,结合蛋白,果蝇,家蚕

来源: 江苏科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 江苏科技大学

分类号: Q75

总页数: 69

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