南极硅藻及其共附生菌的DMSP代谢机制研究

论文摘要

二甲基巯基丙酸内盐（3-dimethylsulphoniopropionate,DMSP）是海洋碳硫循环的重要载体物质,其降解产物DMS和它的氧化产物参与地球气候调节。DMSP主要是由海洋浮游植物产生,对浮游植物适应环境变化具有重要调节作用。南极硅藻（Nitzschia sp.ICE-H）是南极冰藻中的优势藻种,但目前南极硅藻能否产生DMSP及其合成机制仍然未知。因此,本文以南极硅藻（Nitzschia sp.ICE-H）为研究对象,针对DMSP合成机制开展研究,通过对南极硅藻转录组学研究,查找DMSP合成关键基因;通过对DMSP合成关键基因的克隆表达及生物信息学分析,完善南极硅藻的DMSP代谢途径;结合南极硅藻DMSP合成及其环境响应研究,阐明南极硅藻DMSP生物合成机制。在此基础上,开展南极硅藻共附生真菌的DMSP降解机制研究,通过对其进行基因组测序,查找关键降解基因,探讨南极真菌的DMSP降解机制。具体研究结果如下:1)采用吹扫-捕集检测技术,开展不同温度与盐度对南极硅藻DMSP合成的调控研究,探讨极端环境中南极硅藻DMSP合成规律。结果表明,不同温度、盐度均会影响南极硅藻的DMSP产量。低温（0 oC）能够明显提高南极硅藻细胞内的DMSP产量（可达53.21 nmol/107cells）,高温无显著影响;高盐度（64‰）明显促进南极硅藻的DMSP合成（可达104.45 nmol/107cells）;但过高（96‰）或过低（16‰）的盐度均会抑制硅藻的DMSP产量。可见,低温与高盐促进了DMSP的合成,推测与DMSP的冷冻调节与渗透调节作用有关。2)根据南极硅藻无参转录组测序结果,筛查并克隆得到2个DMSP合成关键酶S-methyltransferase基因全长。生物信息学分析可知,ORF全长分别为1386 bp和1140 bp,编码461和379个氨基酸,理论相对分子质量为50.74 KDa和42.78 KDa。二者位于细胞胞质中,均属于甲基转移酶家族—AdoMet-MTases superfamily超家族,且无跨膜结构域和N端无信号肽结构。二者均由6个同一单聚体构成的六聚体,蛋白保守性低,出现了分化现象;进化树分析显示二者与Sediminimonas qiaohouensis、Actinopolymorpha singaporensis等物种聚为一支,表明这些蛋白进化关系相对较近。3)构建南极硅藻的S-methyltransferase基因重组工程菌,进行低温诱导表达试验。将重组质粒转入Transetta（DE3）表达感受态细胞后,16 oC、160 rpm、0.5mM IPTG诱导12 h后,进行细胞破碎和SDS-PAGE电泳。电泳表明,二者分别在50 KDa和40 KDa处有一条较粗的蛋白条带,而对照组无此条带,说明重组工程菌成功诱导出目的蛋白。经分析发现,目的蛋白均存在于细胞破碎沉淀中,主要以包涵体的形式存在。4)筛选获得了三株可降解DMSP并产生DMS的南极硅藻共附生菌:腥掷孢菌（Tilletiopsis sp.ICE-01）,枝孢菌（Cladosporium sp.ICE-02）和曲霉菌（Aspergillus sp.ICE-03）。三株真菌均可以DMSP为唯一碳源与能源,裂解产生DMS;其中腥掷孢菌对DMSP的降解量与DMS产量均为最多,分别为:57.13nmol与59.91 nmol。对腥掷孢菌进行基因组学测序,得到编码基因（24952761bp）、注释基因（8494123 bp）及非编码RNA的基本信息;并参照数据库的进行基因功能注释,获得两条DMSP裂解酶的dddD基因序列,属于乙酰辅酶A转移酶（CoA-transferase familly III）,可裂解DMSP生成DMS和3-羟基丙酸（3-hydroxypropionate）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
•   1.1 DMSP研究历程
•   1.2 DMSP生物合成
•     1.2.1 L型甲硫氨酸（L-Met）合成
•     1.2.2 L-Met转化与DMSP生成
•     1.2.3 DMSP生物合成种类
•   1.3 影响DMSP合成的因素
•     1.3.1 光照
•     1.3.2 盐度
•     1.3.3 温度
•     1.3.4 氧化压力
•   1.4 DMSP的分布
•     1.4.1 海水DMSP的浅层分布
•     1.4.2 沉积物中DMSP分布
•     1.4.3 生物体内DMSP分布
•   1.5 DMSP的代谢通路
•   1.6 DMSP生物/生态学功能
•     1.6.1 海洋微生物碳和硫元素的重要来源
•     1.6.2 生理生化功能
•     1.6.3 气候活性物质—DMS
•     1.6.4 其他功能
•   1.7 DMSP的检测方法
•   1.8 拟采用的技术路线、目的及意义
•     1.8.1 拟采用的研究路线
•     1.8.2 本论文的目的、意义
• 第二章 南极硅藻（Nitzschia sp.ICE-H）的转录组学研究
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 仪器与试剂
•     2.1.2 f/2 培养基
•     2.1.3 藻种与培养
•     2.1.4 建库测序
•     2.1.5 生物信息学分析
•   2.2 结果与说明
•     2.2.1 测序数据质量评估
•     2.2.2 基因功能注释
•     2.2.3 CDS预测
•     2.2.4 SSR分析
•     2.2.5 基因表达水平分析
•     2.2.6 南极硅藻（Nitzschia sp.ICE-H）部分DMSP合成酶基因全长
• 第三章 南极硅藻（Nitzschia sp.ICE-H）DMSP的合成及其环境响应研究
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 仪器与试剂
•     3.1.2 试验方法
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 DMS工作曲线
•     3.2.2 DMSP验证结果
•     3.2.3 硅藻生长曲线
•     3.2.4 DMSP含量检测
•   3.3 讨论与小结
• 第四章 南极硅藻（Nitzschia sp.ICE-H）S-甲基转移酶的原核表达与生物信息学分析
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 仪器与试剂
•     4.1.2 藻种与培养
•     4.1.3 试验方法
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 总RNA提取与检测
•     4.2.2 目的基因扩增
•     4.2.3 阳性克隆检测
•     4.2.4 生物信息学分析
•     4.2.5 SDS-PAGE电泳
•   4.3 讨论与小结
• 第五章 可代谢DMSP南极硅藻共附生菌的筛选与验证
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 菌种来源
•     5.1.2 仪器与试剂
•     5.1.3 试验方法
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 降解菌筛选、鉴定结果
•     5.2.2 降解菌形态学观察
•     5.2.3 DMSP与 DMS的测定
•   5.3 讨论与小结
• 第六章 南极真菌-腥掷孢菌（Tilletiopsis sp.ICE-01）的基因组测序及生物信息学分析
•   6.1 材料与方法
•     6.1.1 菌种来源
•     6.1.2 仪器与试剂
•     6.1.3 试验方法
•   6.2 结果与分析
•     6.2.1 基因组基本数据结果
•     6.2.2 降解DMSP的关键基因和代谢通路分析
•   6.3 讨论与小结
• 第七章 总结与展望
•   7.1 总结
•   7.2 后续计划
•     7.2.1 酶活验证
•     7.2.2 降解基因的克隆表达
• 论文创新点
• 参考文献
• 附录
• 作者简介
• 硕士期间发表论文
• 致谢
• 项目资助

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王西西

导师: 缪锦来

关键词: 二甲基巯基丙酸内盐,南极硅藻,腥掷孢菌,代谢机制,原核表达

来源: 自然资源部第一海洋研究所

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 自然资源部第一海洋研究所

基金: 国家重点研发计划(2018YFD0900705,2018YFD0901103),国家自然科学基金(41576187,41776203),山东省自然科学基金(ZR2019BD023),山东省重点研发计划(2018GHY115034,2018YYSP024,2017GHY15112),中央级公益性科研院所基本科研业务专项(2016Q10),中国大洋协会深海生物资源计划课题(DY135-B2-14)

分类号: Q936

总页数: 122

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