枯草芽孢杆菌启动子片段的克隆及分子改造

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种,属于好氧型革兰氏阳性菌,它具有遗传背景清晰、易分离培养、胞外分泌能力强和非致病性等优点,十分适合作为表达和分泌异源蛋白的宿主菌株,作为芽胞杆菌属的模式菌株广泛应用于工业化生产。工业生产的实践结果表明,现有的枯草芽孢杆菌载体系统不能满足越来越多的外源基因的高效表达,因此尝试从表达系统中的启动子入手,筛选并经过改造后获得新型的能满足尽可能多的外源基因表达要求的强启动子,从而提高枯草芽孢杆菌系统的表达效果。本课题通过构建探针型载体筛选具有启动能力的片段,以卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因构建了双向启动子探针载体pKT2,然后提取土壤菌DNA进行筛选启动子,但是由于转化枯草芽孢杆菌效率太低无法获得足够的转化子来筛选得到高效的启动子,最终选择对现有的组成型启动子P43和诱导型启动子Pglv进行突变改造,经过定点突变和关键保守序列替换杂交后,根据数据库比对分析,分别筛选到新启动子P43-35、P43-35quan、P43-35-10、P43-Pglv-35、Pglv-10、Pglv-35、Pglv-P43-10。分别以麦芽糖α-淀粉酶基因sva和碱性磷酸酶基因phoA为报告基因构建相关表达载体来检验启动子的功能,其中以麦芽糖α-淀粉酶基因sva为报告基因构建重组载体,构建成功后均转化进入宿主菌B.subtilis 1A857中进行表达,测得发酵液的最高粗酶酶活单位分别为1.214U/mL、1.334U/mL、1.042U/mL、1.1U/mL、1.184U/mL和 15.284 U/mL、14.635 U/mL、18.849 U/mL、7.651 U/mL,菌液最高OD595分别为2.553、2.188、2.485、2.338、2.57、5.433、5.847、5.29、7.103。其中只有针对组成型启动子P43的-35区进行突变的突变体pHS-P4335和诱导型启动子Pglv的-35区进行突变的突变体pHS-Pglv35的粗酶活有一定提升,分别为突变前的1.099倍和1.233倍,其余突变体的表达情况均呈现下降状态。以碱性磷酸酶基因phoA为报告基因构建重组载体pHP-Pglv、pHP-Pglv35,构建成功后均转化进入宿主菌B.subtilis 1A857中进行发酵表达,测得发酵液的最高粗酶酶活单位分别为10.176 U/mL和6.992 U/mL,较突变之前降低了约31%。研究表明对启动子的核心保守序列进行突变可能会带来一定正向的影响,提高启动子的转录活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
•   1.1 枯草芽孢杆菌简介
•   1.2 枯草芽孢杆菌的应用
•     1.2.1 枯草芽孢杆菌在工业生产上的应用
•     1.2.2 枯草芽孢杆菌在农副产品方面的应用
•     1.2.3 枯草芽孢杆菌在现代科学方面的应用
•   1.3 枯草芽孢杆菌表达系统
•     1.3.1 枯草芽孢杆菌菌株发酵优缺点
•     1.3.2 枯草芽孢杆菌表达载体
•   1.4 枯草芽孢杆菌启动子基本结构
•     1.4.1 启动子结构
•     1.4.2 枯草芽孢杆菌启动子的因子
•   1.5 启动子的分类
•     1.5.1 组成型启动子
•     1.5.2 诱导型启动子
•   1.6 通过启动子改造实现基因高效表达
•     1.6.1 启动子的克隆
•     1.6.2 改造启动子以实现目的基因的高效表达
•   1.7 启动子的预测及分析
•   1.8 研究目的与意义
•   1.9 技术路线
• 第二章 材料与方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株与质粒
•     2.1.2 主要酶和试剂
•     2.1.3 主要仪器及设备
•     2.1.4 主要溶液及培养基
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 本实验所需基本实验操作
•       2.2.1.1 PCR链式反应扩增体系及程序
•       2.2.1.2 各试剂盒提取方法
•     2.2.2 枯草芽孢杆菌启动子筛选
•       2.2.2.1 启动子探针载体的构建
•       2.2.2.2 在土壤菌中利用探针进行启动子的筛选
•     2.2.3 启动子的改造
•       2.2.3.1 启动子P43、Pglv的克隆
•       2.2.3.2 表达载体pHS-promoter的构建
•       2.2.3.3 启动子P43、Pglv的关键位点突变改造
•       2.2.3.4 启动子P43、Pglv的关键位点替换杂交改造
•     2.2.4 启动子在枯草芽孢杆菌中启动α-淀粉酶基因表达
•       2.2.4.1 重组质粒载体α-淀粉酶粗酶活的测定
•       2.2.4.2 表达载体pHP-Pglv和pHP-Pglv35的构建
•       2.2.4.3 重组质粒载体碱性磷酸酶粗酶活的测定
•     2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备、验证与转化
•       2.2.5.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
•       2.2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的验证及转化方法
•     2.2.6 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备、验证与转化
•       2.2.6.1 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备
•       2.2.6.2 枯草芽孢杆菌感受态细胞的验证及转化方法
• 第三章 结果与分析
•   3.1 启动子探针载体的构建
•   3.2 启动子P43、Pglv的改造
•     3.2.1 启动子P43、Pglv的克隆和表达载体pHS-promoter的构建
•     3.2.2 启动子P43关键位点的突变
•     3.2.3 启动子Pglv关键位点的突变
•     3.2.4 复合启动子PP35与PP10的构建
•   3.3 表达载体pHS-promoter在表达宿主中的表达与分析
•     3.3.1 表达载体pHS-P43系列在表达宿主中的表达
•     3.3.2 表达载体pHS-Pglv系列在表达宿主中的表达
•   3.4 表达载体pHP-Pglv和pHP-Pglv35在表达宿主中的表达
• 第四章 讨论
•   4.1 启动子探针的研究
•   4.2 枯草芽孢杆菌启动子的研究及改造
•     4.2.1 枯草芽孢杆菌启动子的研究意义及特征
•     4.2.2 枯草芽孢杆菌启动子的改造
• 第五章 结论与展望
•   5.1 结论
•     5.1.1 启动子探针的构建
•     5.1.2 启动子核心保守序列的突变对基因表达的影响
•     5.1.3 启动子核心保守序列的替换杂交对基因表达的影响
•   5.2 展望
•     5.2.1 启动子筛选探针的改进
•     5.2.2 启动子的进一步分析与改造
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 程媛

导师: 黄日波

关键词: 枯草芽孢杆菌,启动子,启动子改造

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 广西大学

分类号: Q78

总页数: 88

文件大小: 7189K

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