（无锡市中医医院江苏无锡214000）
基金支持：江苏省第十三批“六大人才高峰”高层次人才选拔培养资助项目（WSN-242）；江苏省中医药科技项目（编号LZ11125）；无锡市卫生局卫生科技项目(MD201211)
第一作者简介:王继红，女，1973年生，辽宁省锦州市人，汉族，医学博士，主任医师。研究方向糖尿病视网膜病变的分子生物学机制及中西医治疗。
摘要目的探讨法舒地尔（fasudil）在高糖条件下对猴脉络膜-视网内皮细胞(RF/6As)损伤时的单层通透性及Occludin表达的影响。方法体外培养RF/6As,分为等渗葡萄糖处理组(对照组)、40mmol/L葡萄糖处理组(高糖组)及fasudil+40mmol/L葡萄糖处理组(fasudil+高糖组)。各组分别培养1、3、5、7d,应用倒置显微镜观察培养的RF/6As形态,以辣根过氧化物酶(HRP)作为示踪剂用二室弥散系统检测RF/6As单层通透性的变化,采用Westernblot法检测Occludin在3d、7d各组细胞中的表达量。结果第3、5、7天,高糖组RF/6As随时间延长逐渐变形,正常细胞数量明显减少,单层通透性逐渐增加;3个时间点HRP的A值分别为0.058±0.015,0.116±0.027,0.217±0.036明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0101)。fasudil+高糖组仅于7d时细胞形态略有改变,5d及7d时HRP的A值分别为0.067±0.004和0.113±0.008,较对照组有所增加,差异均有统计学意义(P<0.01);但明显低于高糖组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Westernblot检测显示,7d时fasudil+高糖组Occludin灰度值为0.69±0.14，,高糖组为0.45±0.13差异有统计学意义(P<0.01)。结论高糖可引起RF/6As单层通透性增加及Occludin的表达降低,而fasudil可通过上调Occludin的表达,从而减轻高糖引起RF/6As的损伤，对糖尿病视网膜病变起到预防和保护作用。
关键词：法舒地尔、高糖、RF/6As、Occludin、通透性
糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)糖尿病的主要微血管并发症之一[1]。临床流行病学统计在发病15-20年的糖尿病患者中的DR发病率高达62.5%,成为致盲的主要原因[2]。糖尿病患者视网膜微血管细胞长期处在高糖的环境下。导致细胞壁通透性增加，脆性加大，过度增殖、出血、血管闭塞等病理变化，终末致使视网膜微血管细胞结构完全丧失，进而导致患者出现不同程度的视力下降，严重者出现是失明[3]。血－视网膜屏障稳定的稳定，有赖于血管内皮细胞、周细胞、基底膜结构和功能的完整性。Occuldin是一种重要的跨膜蛋白作为内皮细胞间紧密连接的主要成分，是导致细胞收缩,内皮细胞裂隙形成,通透性增高的重要原因。Rho/ROCK信号通路在细胞连接、肌动蛋白细胞骨架重组、细胞迁移等方面均起到重要作用，并可通过磷酸化肌动蛋白轻链(myosinlightchain，MLC)影响应力纤维和黏着斑的形成[4]。随着对Rho／ROCK通路研究的深入，逐渐发现ROCK与血糖的重要关系。机体内高浓度的葡萄糖水平可以上调ROCK的表达，从而激活体内多个ROCK的下游信号通路，导致平滑肌功能异常、炎症反应、蛋白合成异常等，而这些均与糖尿病的多项并发症密切相关。而在高糖环境下视网膜内皮细胞的损伤是否有该通路的参与国内外相关的报道还较少。而盐酸法舒地尔作为ROCK特异的抑制剂，可用于治疗心力衰竭、心肌梗死等多种疾病。但在糖尿病视网膜病变治疗的应用还比较少。因此通过本研究探讨高糖条件下猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6As)损伤时的单层通透性、Occuldin的变化及法舒地尔对上述变化的影响及机制,现报道如下
1材料与方法
1.1材料
RF/6As(中国科学院上海细胞库);MEM培养基(美国Gibco公司);胎牛血清(美国Hyclone公司);D2葡萄糖、HRP、罗丹明标记毒伞素(美国Sigma公司);fasudil(天津红日药业股份有限公司)。Transwell培养板(美国Corning公司);PowerPac3000型电泳仪、680型酶标仪(美国BIO2RAD公司);922Ⅱ型超声波细胞粉碎机
(宁波新芝科器研究所)。
1.2方法
1.2.1细胞培养及实验分组RF/6A细胞在MEM完全培养基中于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度孵箱中培养,按照1∶2～1∶4传代培养,传3代以上的细胞用于实验,待细胞生长至70%融合时换以MEM完全培养基为基础的条件培养基,分为3组。对照组:MEM培养基中含葡萄糖5.5mmol/L;高糖组:MEM培养基中含葡萄糖40mmol/L;fasudil+高糖组:MEM培养基中含葡萄糖40mmol/L+fasudil(10μmol/L)。分别于1、3、5、7d进行观察并拍照。
1.2.2致密RF/6A单层通透性的检测参照Essler等[5]的方法,用辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)作示踪剂,检测血管内皮细胞单层的通透性变化。将RF/6A细胞接种在Transwell小室(直径12mm,孔径3μm)多聚碳脂滤膜的弥散模型中细胞接种密度为3×105/小室,24h后细胞基本贴壁并融合为致单层,PBS液洗涤3遍,并分组加入条件培养基,培养至1、3、5、7d时进行检测,检测前4h换成相应的无血清培养基,用PBS冲洗3遍整个体系均换成PBS,每孔加入0134g/LHRP溶液100μL,作用5min后,取下室液50μL与850μLHRP反应液混合(0.05mol/LPBS,体积分数013%H2O2,012%愈创木酚溶液),室温下反应15min,加入2mol/LH2SO4100μL终止反应。用酶标仪检测HRP在470nm处的吸光度(A)值。HRP的A值是反映RF/6As单层通透性的指标,A值越大,RF/6As单层通透性越强。
1.2.3Westernblot检测Occludin的表达细胞分组培养后3d、7d,弃培养液,用温PBS冲洗2～3遍,加入适量预冷裂解液置于冰上裂解15min,用细胞刮刀刮下细胞,收集于EP管内,200W超声裂解细胞3s×2次,4℃、1000g离心2min。采用考马斯亮蓝法,测定上清蛋白浓度,将所有蛋白样品调至等浓度上样(上样前100℃水浴3min),以80V电压常规SDS2PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上,用封闭液(1×TBST,5%脱脂奶粉)4℃封闭过夜,再用抗体稀释液(1×TBST,1%脱脂奶粉)1∶250稀释一抗,与经封闭液处理的PVDF膜置于小封口塑料袋内37℃孵育2h。1×TBST液洗膜3次,每次20min。然后以同样方法,1∶4500稀释二抗,37℃孵育1h,1×TBST液洗膜30min×3次。将膜置于10mL含BCIP(33μL)/NBT(66μL)的染色液中,于室温下轻轻振摇,使蛋白条带逐渐显影、定影,胶片洗涤干燥,利用Kodak电泳图像分析系统对图片各电泳条带亮度进行扫描,以β2actin为对照,对显影相对强度进行统计分析。
1.3统计学方法
采用SPSS1310统计学软件进行统计分析。实验测试指标以用均数±标准差（mean±SD)表示,采用Levene检验证实各组数据资料方差齐。不同时间点各组HRPA值的差异比较、不同时间点各组表达量的差异比较均采用单因素方差分析,组间的多重比较采用LSD2t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组RF/6As形态的变化对照组RF/6As呈单层扁平上皮状,多数为椭圆形,少数呈梭形,细胞界限清楚,呈典型的鹅卵石样外
观(图1A)。高糖组随着时间的变化RF/6As形态则明显不同:3d高糖组RF/6As胞体边缘出现收缩,部分细胞变圆,部分形态不规则;5d高糖组RF/6As大部分伸出突起,形态呈不规则形,且细胞边界略显模糊,细胞间隙增大;7d组RF/6As收缩明显,部分伸出长伪足,胞体变形,边界模糊,细胞间形成明显的裂隙,细胞生长数量较对照组明显减少(图1B)。fasudil+高糖组3个时间点细胞形态变化不大,仅7d时细胞略变圆,细胞数量略减少(图1C)
2.2RF/6As单层通透性的变化
细胞培养1d时,对照组、高糖组、fasudil+高糖组A值分别为0.009±0.001、0.032±0.032、0.010±0.001,组间比较差异无统计学意义(F=1.380,P>0.05),高糖组RF/6As的通透性随着时间的延长而逐渐增强。7d时对照组、高糖组、fasudil+高糖组A值分别为0.013±01002、0.217±0.036、0.113±0.008,组间比较差异有统计学意义(F=56.877,P<0.01)。LBP+高糖组在培养5d及7d时的A值较相同时间点高糖组低,差异均有统计学意义(t=5.064,P<0.01;t=4.933,P<0105)(表1)。
表1各时间点不同组别间EC单层通透性的变化比较(,n=3)
注★p<0.01vs对照组;▲p<0.01vs高糖组；
2.3Westernblotting检测Occludin蛋白表达量
Westernblot检测结果显示,在高糖条件下Occludin的表达量随间的增加而升高,3d、7d时高糖组与对照组比较,差异均有统计学意义(t=-8.543,t=-20.143,P<0.01),而这种增高趋势可被fasudil抑制,
7d时fasudil+高糖组、高糖组0.45±0.13的表达量分别为
0.69±0.14、0.45±0.13、,组间差异有统计学意义(t=13.380,P<0101)
Westernblot检测Occludin表达的结果
A组:对照组；B组：高糖组3天，C组：高糖组7天；D组：fasudil+高糖组3天
E组：fasudil+高糖组7天
讨论
早期的糖尿病视网膜病变是以毛细血管形态和功能改变为典型特征，内皮细胞对血管通透性的调节与其表面结构、细胞与基底膜之间的黏附和细胞与细胞之间的连接有密切关系。血－视网膜屏障的完整性是由紧密连接(tightjunction，TJ)和黏附连接构成的密封的连接复合体决定的。紧密连接负责细胞之间的屏障功能，跨膜蛋白、胞质附着蛋白及细胞骨架蛋白共同组成了TJ，Occuldin是一种重要的跨膜蛋白。Occuldin在脑血管内皮中表达最高。其作用（1）紧密连接的重要结构蛋白；（2）调节功能，Occuldin是紧密连接中关键的一个调节蛋白；（3）信号传导，Occuldin蛋白的C末端同时还有信号传导功能，调节Occuldin蛋白的二聚体(4)协同作用，Occuldin与另一种跨膜蛋白Claudin的共聚作用对紧密连接的稳定方面起到重要的作用[6]
糖尿病视网膜病变中最早出现的临床可检测的表现之一为血管渗漏，提示血－视网膜屏障功能的异常是一种早期事件。可能与Occludin蛋白和Claudin家族蛋白存在着密切的联系，葡萄糖，可以激活Na+与葡萄糖的共转运系统。在上皮层顶端表面加入葡萄糖会导致细胞旁通透性增加和TER值降低，伴随着许多形态学变化，如TJ向内膨胀和ZO-1与TJ分离，Ocucldin和Z0-2重新分布，肌球蛋白轻链磷酸化和连接周围肌动蛋白和肌球蛋白环收缩导致TJ开放。
在本实验证明高糖组随着时间的延长视网膜内皮细胞的通透性增强，说明明,高糖环境可以诱导RF/6As的通透性增强并呈时间依赖关系与刘学政等[7]的研究相一致。与此同时Ocucldin的表达与随着高糖的损害而不断的较少。跨膜蛋白Occludin的低表达恰恰证明了通透性的增强是紧密连接蛋白功能下降的重要因素，这点充分说明了，高糖引起的渗漏性增强的机制中，Ocucldin蛋白的表达降低，导致紧密连接的破坏很可能就是其中的重要机制之一。
Rho／ROcK信号通路是真核细胞内一类非常重要的信号转导途径。目前已有大量研究关注，Rho／ROCK信号通道是否参与多系统病理生理过程，及该信号通道失调与细胞增殖、迁移、存活及凋亡的关系。近期研究发现，Rho／ROCK信号通道在中枢神经系统损伤后被异常激活，抑制通道可以通过多种机制改善神经功能的恢复。而目前其在临床上的应用多基于抑制平滑肌收缩而扩张血管的机制，如蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛、冠状动脉狭窄等缺血症状的改善[8]。然而Rho／ROcK信号通路作用十分广泛，在糖尿病视网膜病变中发挥作用的具体机制不完全清楚，因此，实验着眼于调节Rho／ROcK信号通路是否可以视网膜内皮细胞的紧密连接，为DR患者的临床干预提供新思路。
酸法舒地尔(hydroxyfasudil)，是法舒地尔的主要代谢产物，对Rho激酶具有更特异的抑制效应。它们与BA竞争Rho激酶催化结构域的ATP结合位点从而抑制了Rho激酶的活性。肌球蛋白磷酸化酶通过肌球蛋白结合亚基与磷酸化的肌球蛋白轻链(MLC)相结合，并使其脱磷酸。Rho激酶可磷酸化肌球蛋白结合亚基，从而导致MLCP失活[9]。法舒地尔于1999年在日本上市，临床用于改善和预防蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛及引起的脑缺血症状。
而本实验中法舒地尔作为Rho信号通路的抑制剂，正是因为其抑制了高糖激活的Rho/ROCK信号通路，抑制ROCK的活性，使肌球蛋白轻链去磷酸化，从而抑制了紧密连接蛋白的构型的改变，稳定了紧密连接，当然也保护了视网膜血管内皮细胞的通透性，综上所述法舒地尔可以抑制高糖条件下血管内皮细胞Occludin蛋白的低表达的，从而降低了血管内皮细胞的通透性，对高糖损害下的视网膜内皮细胞有较好的保护作用。
参考文献
[1]RosebergerDF,diabeticretinopathy:currentconceptsandemegingtherapy.EndocinalMetabClinNorthAm2013;42(4):721-745
[2]LiJK,WeiF，JinXH,etal.ChangeninvitreousVEGF,bFGFandfibrosisinproliferativediabeticretinopathyafterintravitrealbevacizumab[J].IntJOphthamol,2015,8(6）：1202-1206
[3]王芳，王春芳，闫建林，45岁以上糖尿病患者中糖尿病视网膜病变的患病率调查及相关危险因素分析.中华实验眼科杂志2013:31（8）：783-787
[4]AmanoMN,akayamaMKaibuchiK．Rho-kinase/ROCK：akeyregulatorofthecytoskeletonandcellpolarit.Cy-toskeleto.2010.67：545～554．
[5]MandarinoLJ,FinlaysonJ,HassellJR.Highglucosedownregulates
glucosetransportactivityinretinalcapillarypericytesbutnotendothelialcells[J].InvestOphthalmolVisRes,1994,35(8)∶964-972.
[6]AsakaM,HiraseT,Hashimoto-KomatsuA,etal.Rab5a-mediatedlocalizationofclaudin-lisregulatedbyproteasomesinendotheliacells[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2011.300:87-96
[7]刘学政,左中夫,冯闯等.Ang-1对高糖环境中RF/6A单层的保护作用[J].眼科研究,2009,527(5):380-383.
[8]NozakiY，KinoshitaK，HinoS，eta1．SignalingRho—ki-nasemediatesinflammationandapoptosisonT-cellandre-naltubulesinnephrotoxieity[J]．AmJPhysiolRenalPhysiol，2015，308(8)：F899-F909．
[9]AritaR，NakaoS，KitaT，eta1．AkeyroleforROCKinTNF-α-mediateddiabeticmicrovasculardamage．InvestOphthalmolVisSci，2013，54：2373～2383
附图