论文摘要
节杆菌(Arthrobacter sp.)是一类广泛存在于土壤中高GC含量的放线菌,它具有极强的环境适应性,能以多种环境污染物作为唯一碳源或氮源,从而降解该环境污染物。随着全基因组测序技术和分子生物学技术的发展,从分子水平探究节杆菌降解环境污染物的机制已经成为关注热点。基因编辑作为一种基因功能的研究手段,在微生物研究中发挥了巨大作用。目前,节杆菌的基因编辑技术还不完善,存在很大的局限性,使其无法在科研工作中广泛使用。本研究所用的节杆菌HW08是由本实验室从埋有黄花棘豆的土壤中分离得到的革兰氏阳性细菌,具有高效降解苦马豆素(SW)能力。本研究首先利用自杀性质粒pK18mobsacB构建节杆菌HW08基因敲除载体,对与节杆菌HW08降解SW相关的NADP依赖型乙醇脱氢酶(ADH)基因进行基因敲除。然后,本研究利用重叠PCR和定点突变等技术将穿梭质粒pART2改造为一个诱导表达型载体pARTP,为构建节杆菌HW08 CRISPR-Cas9基因敲除体系提供载体骨架。获得研究结果如下:1.对ADH蛋白进行了生物信息学分析ADH的生物信息学分析表明该酶是一个分子量为36.638 kDa稳定的酸性非分泌蛋白并且含有烯酰还原酶结构域、ADHs催化结构域、C-末端、锌原子的保守结合结构域和NAD(P)辅因子的结合结构域。NADP与ADH的氨基酸残基His42,Ser43,His63,Thr162,Gly184,Gly185,Ser246和Arg338形成氢键;SW与ADH的氨基酸残基Arg24,His133和Val135形成氢键。2.构建了pK18mobsacB-ΔADH载体利用同源重组的方法构建了以自杀性质粒pK18mobsacB为骨架的节杆菌HW08基因敲除载体。根据节杆菌HW08 ADH基因的上下游DNA序列设计同源臂序列并进行PCR扩增,构建了敲除载体pK18mobsacB-ΔADH。3.ADH基因缺失株筛选采用电击转化的方式将敲除载体转入节杆菌HW08感受态细胞中,利用pK18mobsacB载体的特性筛选ADH基因缺失株,通过验证引物PCR鉴定转化子且测序进一步验证,最终获得ADH基因缺失株。4.构建了诱导表达型载体pARTP为了获得构建节杆菌HW08 CRISPR-Cas9基因敲除体系的载体。采用重叠PCR和定点突变等技术将穿梭载体pART2改造为一个组成型表达载体pARTF,其次,在pARTF载体的基础上添加乳糖操纵子基因(laclq)构建了诱导表达型载体pARTP。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 郭晓虹
导师: 王妍
关键词: 节杆菌,基因敲除
来源: 西北农林科技大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,环境科学与资源利用
单位: 西北农林科技大学
基金: 国家自然科学基金项目(31201959)
分类号: X53;Q78
总页数: 58
文件大小: 3044K
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