节杆菌ADH基因敲除及诱导表达型载体的构建

节杆菌ADH基因敲除及诱导表达型载体的构建

论文摘要

节杆菌(Arthrobacter sp.)是一类广泛存在于土壤中高GC含量的放线菌,它具有极强的环境适应性,能以多种环境污染物作为唯一碳源或氮源,从而降解该环境污染物。随着全基因组测序技术和分子生物学技术的发展,从分子水平探究节杆菌降解环境污染物的机制已经成为关注热点。基因编辑作为一种基因功能的研究手段,在微生物研究中发挥了巨大作用。目前,节杆菌的基因编辑技术还不完善,存在很大的局限性,使其无法在科研工作中广泛使用。本研究所用的节杆菌HW08是由本实验室从埋有黄花棘豆的土壤中分离得到的革兰氏阳性细菌,具有高效降解苦马豆素(SW)能力。本研究首先利用自杀性质粒pK18mobsacB构建节杆菌HW08基因敲除载体,对与节杆菌HW08降解SW相关的NADP依赖型乙醇脱氢酶(ADH)基因进行基因敲除。然后,本研究利用重叠PCR和定点突变等技术将穿梭质粒pART2改造为一个诱导表达型载体pARTP,为构建节杆菌HW08 CRISPR-Cas9基因敲除体系提供载体骨架。获得研究结果如下:1.对ADH蛋白进行了生物信息学分析ADH的生物信息学分析表明该酶是一个分子量为36.638 kDa稳定的酸性非分泌蛋白并且含有烯酰还原酶结构域、ADHs催化结构域、C-末端、锌原子的保守结合结构域和NAD(P)辅因子的结合结构域。NADP与ADH的氨基酸残基His42,Ser43,His63,Thr162,Gly184,Gly185,Ser246和Arg338形成氢键;SW与ADH的氨基酸残基Arg24,His133和Val135形成氢键。2.构建了pK18mobsacB-ΔADH载体利用同源重组的方法构建了以自杀性质粒pK18mobsacB为骨架的节杆菌HW08基因敲除载体。根据节杆菌HW08 ADH基因的上下游DNA序列设计同源臂序列并进行PCR扩增,构建了敲除载体pK18mobsacB-ΔADH。3.ADH基因缺失株筛选采用电击转化的方式将敲除载体转入节杆菌HW08感受态细胞中,利用pK18mobsacB载体的特性筛选ADH基因缺失株,通过验证引物PCR鉴定转化子且测序进一步验证,最终获得ADH基因缺失株。4.构建了诱导表达型载体pARTP为了获得构建节杆菌HW08 CRISPR-Cas9基因敲除体系的载体。采用重叠PCR和定点突变等技术将穿梭载体pART2改造为一个组成型表达载体pARTF,其次,在pARTF载体的基础上添加乳糖操纵子基因(laclq)构建了诱导表达型载体pARTP。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 节杆菌国内外研究进展
  •     1.1.1 节杆菌的概况
  •     1.1.2 节杆菌的降解特性
  •     1.1.3 节杆菌基因编辑技术研究
  •   1.2 细菌基因编辑技术研究
  •     1.2.1 细菌基因编辑方法概述
  •     1.2.2 同源重组技术
  •     1.2.3 RNA引导核酸酶介导的基因编辑技术
  •   1.3 小结
  • 第二章 节杆菌ADH基因敲除载体的构建
  •   2.1 试验材料和试剂
  •     2.1.1 试验所需试剂
  •     2.1.2 试验常用工具酶和试剂盒
  •     2.1.3 试验仪器
  •     2.1.4 实验所需菌株和质粒
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 ADH生物信息学分析
  •     2.2.2 引物设计
  •     2.2.3 节杆菌HW08 基因组的提取
  •     2.2.4 E.coli DH5α中质粒提取
  •     2.2.5 PCR扩增
  •     2.2.6 DNA的纯化回收
  •     2.2.7 目的片段与载体的双酶切
  •     2.2.8 目的片段与载体的连接反应
  •     2.2.9 感受态的制备与转化
  •     2.2.10 pK18mobsacB-ΔADH载体构建
  •     2.2.11 重组质粒鉴定
  •     2.2.12 缺失突变体筛选
  •     2.2.13 薄层层析色谱验证目的基因功能
  •   2.3 实验结果
  •     2.3.1 生物信息学分析
  •     2.3.2 节杆菌HW08 基因组提取结果
  •     2.3.3 ADH基因敲除载体的构建
  •     2.3.4 ADH基因缺失菌株的筛选
  •     2.3.5 薄层色谱检测
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第三章 诱导表达型载体pARTP的构建
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 实验所需菌株和质粒
  •     3.1.2 试验所需引物
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 定点突变
  •     3.2.2 PCR扩增体系和条件
  •     3.2.3 限制性核酸内切酶酶切体系
  •     3.2.4 连接反应体系
  •     3.2.5 细菌质粒的提取
  •     3.2.6 感受态的制备及转化方法
  •     3.2.7 组成型表达载体pARTF构建
  •     3.2.8 诱导表达型载体pARTP构建
  •   3.3 实验结果
  •     3.3.1 组成表达型载体构建
  •     3.3.2 诱导表达型载体pARTP构建
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第四章 结论
  • 附录
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简历
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 郭晓虹

    导师: 王妍

    关键词: 节杆菌,基因敲除

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家自然科学基金项目(31201959)

    分类号: X53;Q78

    总页数: 58

    文件大小: 3044K

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