中间锦鸡儿CiCPK32基因的克隆与功能分析

论文摘要

钙依赖型蛋白激酶（Calcium dependent proteinkinase,CDPK/CPK）,广泛存在于植物和原生生物中,作为Ca2+的受体蛋白和效应蛋白在信号转导过程中起着关键的作用。并且,CPKs在植物正常生长和抵抗逆境过程中具有重要作用。中间锦鸡儿（Caragana intermedia）,具有耐旱、耐寒、耐高温、耐盐碱特点,是我国北方荒漠化地区的优良造林树种。本研究以中间锦鸡儿为材料,通过RACE技术克隆到一个CiCPK32基因,并对其在不同胁迫响应中所发挥的功能做了初步的研究,结果如下:1.CiCPK32基因cDNA长2074bp,开放阅读框长1566bp,编码521个氨基酸,预测的蛋白的分子量为58.91kD。经氨基酸序列比对与系统进化分析显示,该蛋白与拟南芥CPK32（AT3G53040）一致性达77%,因此将其命名为CiCPK32。2.通过实时荧光定量PC R对CiCPK32基因在不同逆境胁迫下表达量进行了检测,结果显示该基因受干旱、ABA、高盐等处理的诱导,推测该基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。3.构建了过表达载体p35S::CiCPK32-HA,并将其转化野生型拟南芥。经过qRT-PCR检测发现,转基因拟南芥纯合体株系中CiCPK32基因表达均有不同程度的增加。4.在400mM甘露醇、100mMNaCl和0.4μMABA处理下,CiCPK32基因过表达拟南芥的萌发率均高于对照;在12μMABA处理下,CiCPK32基因过表达拟南芥根长均高于对照。5.三周龄的CiCPK32基因过表达拟南芥的失水率低于对照;干旱处理后过表达株系的存活率明显高于对照。6.在100μm ABA处理后,各过表达株系中参与胁迫响应基因的表达均上调。综上所述,CiCPK32正调控拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 引言
• 2+与细胞信号转导'>  1.1 Ca²⁺与细胞信号转导
•   1.2 钙依赖蛋白激酶（CPK）的研究进展
•     1.2.1 CPK的发现及功能研究
•     1.2.2 CPK在植物体内的分布及定位
•     1.2.3 CPK的结构和生化性质
•     1.2.4 参与植物的胁迫应答
•   1.3 中间锦鸡儿
•   1.4 研究目的和意义
•   1.5 技术路线图
• 2. 实验材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 植物材料
•     2.1.2 菌株
•     2.1.3 质粒
•   2.2 实验药品及仪器
•     2.2.1 实验试剂及酶
•     2.2.2 实验药品
•     2.2.3 实验所用试剂盒
•     2.2.4 抗生素
•     2.2.5 培养基和相关试剂的配置
•     2.2.6 实验仪器
•     2.2.7 本研究涉及的引物序列
•     2.2.8 相关软件
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 中间锦鸡儿处理方法
•     2.3.2 拟南芥处理方法
•     2.3.3 植物总RNA提取及cDNA的合成
•     2.3.4 基因表达分析
•     2.3.5 目的基因的克隆
•     2.3.6 目的片段与克隆载体的连接
•     2.3.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与目的片段的转化
•     2.3.8 PCR产物回收纯化与质粒提取
•     2.3.9 基因生物信息学分析
•     2.3.10 中间锦鸡儿CiCPK32基因表达载体的构建并转化拟南芥
•     2.3.11 不同处理下种子萌发率的检测
•     2.3.12 失水率检测
•     2.3.13 干旱胁迫表型检测及存活率的测定
•     2.3.14 ABA信号途径基因和胁迫相关基因的检测
• 3 结果与分析
•   3.1 中间锦鸡儿CiCPK32基因全长cDNA的克降
•   3.2 中间锦鸡儿CiCPK32基因生物信息学分析
•     3.2.1 中间锦鸡儿CiCPK32基因序列分析
•     3.2.2 CiCPK32蛋白理化性质分析
•     3.2.3 CiCPK32蛋白磷酸化和糖基化位点分析
•     3.2.4 CiCPK32蛋白的二级结构预测
•     3.2.5 蛋白质保守结构域分析
•     3.2.6 CiCPK32蛋白与其他物种CPK类蛋白多重比对
•     3.2.7 CiCPK32蛋白的系统进化分析
•   3.3 中间锦鸡儿CiCPK32基因表达特性分析
•   3.4 CiCPK32基因过表达纯合体的筛选及表达量的检测
•     3.4.1 过表达载体pCanG-CiCPK32的构建
•     3.4.2 过表达CiCPK32转基因拟南芥纯合体株系的获得
•     3.4.3 过表达CiCPK32拟南芥纯合体株系转基因表达量的检测
•   3.5 过表达CiCPK32基因拟南芥种子萌发对渗透胁迫耐受性检测
•   3.6 过表达CiCPK32基因拟南芥种子萌发对盐胁迫耐受性检测
•   3.7 过表达CiCPK32基因拟南芥干旱胁迫表型及失水率检测
•   3.8 过表达CiCPK32基因拟南芥种子萌发对ABA的耐受性检测
•   3.9 ABA对过表达CiCPK32基因拟南芥幼苗根长的影响
•   3.10 ABA信号通路基因和胁迫响应基因表达量检测
• 4 讨论
•   4.1 CiCPK32表达模式分析
•   4.2 CiCPK32功能分析
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 牛俊美

导师: 丛靖宇,张秀娟

关键词: 中间锦鸡儿,拟南芥,干旱,盐胁迫,功能分析

来源: 内蒙古农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 内蒙古农业大学

分类号: Q943.2

总页数: 55

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