1长沙市妇幼保健院湖南长沙410007；
2北京博奥晶典生物技术有限公司北京经济技术开发区101111
【摘要】目的进行湖南部分地区新生儿耳聋基因筛查研究。方法2017年4月—12月长沙与岳阳地区共5502名新生儿出生后采集新生儿足跟血，采用九项遗传性耳聋基因检测试剂盒（微阵列芯片法）进行基因检测。结果通过基因芯片检测发现215例耳聋基因突变携带者，携带率3.91%（215/5502）。耳聋基因突变中GJB2基因突变携带者135例，携带率2.45%（135/5502）；SLC26A4基因突变携带者51例，携带率0.93%（51/5502），其中2168A>G纯合突变1例，但听力筛查通过；MT-RNR1基因突变携带者20例，携带率0.36%（20/5502）；GJB3基因突变携带者6例，携带率0.11%（6/5502），其中538C>T杂合突变1例；双重杂合突变3例，分别是1例GJB2：235delC/MT-RNR1：1555A>G，1例GJB2：235delC/SLC26A4：IVS7-2A>G，1例GJB2：235delC/SLC26A4：2168A>G。结论耳聋基因筛查应用，可以发现耳聋基因GJB2和SLC26A4基因突变携带者以及药物性耳聋敏感个体，同时对SLC26A4基因纯合突变个体，采取预防干预措施，延缓耳聋发生。
【关键词】新生儿；耳聋基因；基因芯片
5502casesgeneticscreeningofneonatalnonsyndromichearingloss
LiangCheng-Shi*，Zhengli-Liu?，YaJing-Liu?，Hanmei-Li*，Li-Zeng*，Siyi-Ding*，Yingsha-Duan*，Jun-He*
*ChangshaMaternalandChildHealthcareHospital，Changsha，Hunan，410007；
?BeijingCapitalBioTechnologyCo.，Ltd.Economic-TechnologicalDevelopmentArea，101111
Correspondingauthor：Jun-He，E-mail：563574051@qq.com
Abstract：ObjectiveScreeningofneonataldeafnessgenesinpartsofHunan.MethodsFromApril2017toDecember，atotalof5502newbornwereborninChangshaandYueyangarea.Neonatalheelbloodwascollected.Ninegeneticdeafnessgenedetectionkits（Microarray）wasusedforgenedetection.Results215casesofdeafnessgenemutationsweredetectedbygenechipwhichcarryingrate3.91%（215/5502）.Therewere135casesofGJB2genemutantcarriersandthecarryingratewas2.45%（135/5502）；51casescarriersoftheSLC26A4mutantgenewhosecarryingrate0.93%（51/5502）.1case2168A>Ghomozygousmutationhavepassedhearingscreening；20casescarriersofMT-RNR1genewhosecarryingrate0.36%（20/5502）；6casescarriersofGJB3mutantgenewhosecarryingrate0.11%（6/5502）；3casesofdoublemutant.1caseGJB2：235delCheterozygousandMT-RNR1：1555A>Ghomogenousmutation，1casesGJB2：235delCheterozygousandSLC26A4：IVS7-2A>Gheterozygousmutations，1casesGJB2：235delCheterozygousandSLC26A4：2168A>Gheterozygousmutations.ConclusionTheapplicationofhearinglossgenescreeningcandetectthedeafnessgeneGJB2andSLC26A4genemutationcarriersanddruginduceddeafnesssensitiveinpiduals.Atthesametime，takepreventiveinterventionfortheSLC26A4genehomozygousmutantinpidualstodelaythedeafness.
Keywords：Newborns；Deafnessgene；Genechip
目前我国残疾人群大约有8502万，其中听力残疾人群大约为2054万，占比为24%[1]，我国每年还会新出生2.5-3.5万名先天性耳聋患儿[2]，听力障碍会给个人和家庭带来沉重的精神负担和经济压力。OAE或AABR技术进行新生儿听力筛查，操作简单，快捷，目前已经在全国开展广泛筛查。根据已有文献报道，耳聋病因主要包括三类，遗传因素大约占据60%，环境因素大约占20%，还有20%为不明原因，很有可能是遗传因素导致[3]。在遗传因素中当中，4种最常见的致聋基因分别是GJB2、MT-RNR1、SLC26A4和GJB3基因，耳聋基因筛查技术从2008年开始在北京等地区已开展新生儿普遍筛查[4，5]，但是在湖南地区还未有大面积的进行推广筛查。
本研究通过基因芯片法对新生儿进行耳聋基因广泛筛查，尽早发现听力受损者，采取医学干预，同时提前发现耳聋基因突变携带者，为耳聋基因突变携带者未来的婚配以及生育提供精准医学指导，实现三级预防。
1资料与方法
1.1研究对象
研究对象总人数为5502人，分别来自浏阳市妇幼保健院2500人，汨罗市妇幼保健院1001人，宁乡县妇幼保健院1001人，平江县第二人民医院100人，平江县第一人民医院599人，平江县妇幼保健院301人，耳聋基因筛查未通过者，在长沙市妇幼保健院优生遗传科进行遗传咨询。
1.2血斑采集
血斑采集于2017年4月-12月长沙地区和岳阳地区医院出生的新生儿足跟血，所有参与耳聋基因筛查新生儿的家长均已认真阅读并签署知情同意书，一般在新生儿出生3天采集足跟血，血斑直径一般不小于8mm，否则重新采集样本。
1.3耳聋基因检测位点
九个耳聋基因突变位点：GJB2基因35delG、176_191del16、235delC和299_300delAT；SLC26A4基因IVS7-2A>G和2168A>G；线粒体12SrRNA基因1555A>G和1494C>T，GJB3基因538C>T。
1.4基因检测方法
应用九项遗传性耳聋基因检测试剂盒，试剂盒采用多重等位基因特异性PCR结合通用芯片（Tagarray）技术。
1.5PCR扩增
PCR扩增体系与PCR扩增程序参照九项遗传性耳聋基因检测试剂盒说明书。
1.6仪器
PCR扩增仪（ABIVeriti）、芯片杂交采用水浴锅（长风XMTD-6000）、芯片洗涤采用晶芯芯片洗干仪（SlideWasherTM8）、芯片扫描采用微阵列芯片扫描仪（LuxScanTM10K-B），检测结果判读采用遗传性耳聋基因检测芯片判别系统（北京博奥晶典生物技术有限公司）。
1.7筛查阳性个体基因测序
对于筛查阳性的个体会进行Sanger测序，测序实验委托北京博奥医学检验所进行。
2、结果
2.1新生儿耳聋基因筛查结果统计
通过基因芯片检测发现215例耳聋基因突变，突变率3.91%（215/5502）。耳聋基因突变中GJB2基因突变携带者135例，突变携带率2.45%（135/5502）；SLC26A4基因突变携带者51例，突变携带率0.93%（51/5502），其中2168A>G纯合突变1例，IVS7-2A>G杂合突变4例；线粒体12SrRNA基因突变携带者20例，携带率0.36%（20/5502）；GJB3基因突变携带者6例，携带率0.11%（6/5502）；双重杂合突变3例，分别是1例235delC和1555A>G，1例235delC和IVS7-2A>G，1例235delC和2168A>G（见表1），具体芯片检测结果见图一。
表15502例新生儿耳聋基因各突变位点统计
图一基因芯片检测结果
3、讨论
2008年全国第二次残疾人抽样调查资料显示，听力残疾人数的比例排在第二位，目前已经全面推广的听力筛查，简单，快捷，价格低，但存在假阳性[6]。随着分子生物学的不断发展，在倡导精准医疗的大背景下，基因芯片技术目前已成为耳聋基因检测的主流技术[7]，性价比也逐渐显现，也是目前的主要临床选择[8]。
本研究共筛查5502名新生儿，发现耳聋基因突变215例，基因突变携带率为3.91%。湖南部分地区的耳聋基因突变携带率低于已经报道的安徽省马鞍山的5.56%[4]，但是高于四川成都的3.19%[9]，基因突变携带率的差异可能与地区、民族、样本筛查量有关。
目前新生儿的基因筛查已经得到广泛的认识与支持，但是有三个问题值得进一步探讨研究：（1）新生儿只采用听力筛查技术是否可以满足临床需求。从已经发表的文献结合本研究的数据，OAE联合AABR技术检测目前是筛查高危耳聋人群性价比最高，最方便有效的方法，但这两种技术检测容易出现假阴性或假阳性的结果，难以发现迟发性耳聋[10]。在本研究中有1例2168A>G纯合突变的个体，属于后天突发性耳聋，初次听力筛查，右耳未通过，但是听力复筛却通过，其本人发生听力损失的风险非常高，因此需要OAE和AABR技术联合耳聋基因检测同时进行筛查，提高阳性检出率，降低听力损失发生的风险。
（2）新生儿听力筛查与耳聋基因联合筛查，是否可以检测出所有的听力损失。本次耳聋基因筛查发现耳聋基因突变携带者215例，携带率3.91%（215/5502）。根据耳聋基因突变数据库（DeafnessVariationDatabase，http：//deafnessvariationdatabase.org/references）的资料显示，目前耳聋相关的突变已经达到2197个[11]，而且随着高通量测序技术的不断应用，新的突变还在不断发现之中，因此新生儿听力筛查与耳聋基因联合筛查也有一定的局限性，当遇到特殊案例时，需要结合一代测序或高通量测序技术查找听力损失病因。
（3）耳聋基因筛查位点是否越多越好。随着分子诊断技术不断进步，耳聋基因筛查位点不断增长，甚至可以使用高通量测序技术，进行全基因组检测[12]。根据本研究与已发表文献比较，在新生儿中检测相同的四个基因时，9个位点检出突变率为3.91%，检出率差异可能与样本量，地区差异有关[13]。在此次筛查5502人中，未发现35delG突变，该位点在中国汉族人群中突变比率较低，在新疆维吾尔族人群中突变率较高[14]。因此临床检测需要在达到较理想的听力障碍检出率，检测热点突变位点，检测性价比三者之间做出合理的平衡。
在本次筛查研究中，发现1例2168A>G纯合突变的个体，该基因临床表现为后天突发性耳聋，目前该个体听力正常，需要注意生活中的日常保护，避免感冒或使用耳毒性药物，避免剧烈运动等，尽早学会语言，儿保科将会重点跟踪随访，SLC26A4基因纯合突变与大前庭导水管综合症密切相关，需进行影像学检查，未来如果发生听力下降，可能需要佩戴助听器或植入人工耳蜗，同时在未来适婚生育时进行生育指导，其后代生育出听力障碍个体风险非常高，后代的配偶必须进行耳聋基因检测，特别是SLC26A4基因中所有与耳聋相关的突变位点。
线粒体突变属母系（细胞质）遗传，突变基因携带者对氨基糖苷类药物敏感，无论是均质突变或异质突变，当使用少量的氨基糖苷类药物时就可能造成听力损失。突变型的线粒体12SrRNA结构与氨基糖甙类抗生素结合能力比野生型强，结合后的线粒体12SrRNA无法构成具有活性的核糖体30S亚基，进而影响ATP合成，从而导致听毛细胞的逐渐坏死，最终引起患者不可逆的听力损失[15]。此次筛查出线粒体12SrRNA突变20例（0.36%，20/5502），已进行跟踪随访，并重点告知其本人及母系家族成员都禁止（谨慎）使用耳毒性药物，主要是氨基糖苷类药物，避免“一针致聋”。
总之，耳聋基因筛查可以及早发现听力损失的新生儿，确保新生儿在学习语言前，得到及时的干预，避免或延缓听力损失的发生，避免由聋致哑，提前发现耳聋基因携带者，可以减少后代生育个体发生听力损失的风险，同时避免“一针致聋”的案例再次发生。
致谢：
感谢中国出生缺陷干预救助基金会对本项目的捐赠
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