利用转基因家蚕丝腺表达重组hVEGF165的研究

论文摘要

鳞翅目昆虫家蚕（Bombyx mori）是重要的产丝昆虫,至今已被人类饲养利用逾5000年。家蚕丝腺是合成和分泌蚕丝蛋白的专一场所（一头家蚕可生产约0.5克丝蛋白）,是蚕丝业最为核心的生物学基础。近些年来,随着生物技术的蓬勃发展,特别是近年在家蚕基因组计划的推动下,人们对丝腺高效合成与分泌丝蛋白的分子机制有了深入了解,同时也注意到家蚕不仅能用于产丝织绸,其丝腺还是一个理想的生物反应器。2003年,日本学者首次报道了利用转基因家蚕丝腺表达重组人Ⅲ型胶原蛋白,其后,国内外学者利用转基因家蚕丝腺已成功表达了数十种外源蛋白,少数重组蛋白素材已进入中试或产业化生产阶段,表明利用家蚕丝腺作为生物反应器生产重组蛋白,有着巨大的开发应用潜力。人血管内皮生长因子（human vascular endothelial growth factor,hVEGF）是一种对内皮细胞具有高度特异性的有丝分裂原,在血管再生和血管发生中起着重要作用。hVEGF165是hVEGF-A亚型中组织表达频率最高、最具生理相关性的一种异构体,在外周缺血性疾病或慢性伤口的治疗性血管再生研究中效果显著。目前,重组hVEGF165蛋白主要采用大肠杆菌、酵母等原核或低等真核表达系统进行体外表达和研究,其是否适合在家蚕中部丝腺表达尚不清楚。本论文以hVEGF165为靶标,探索利用转基因家蚕中部丝腺表达hVEGF165的可行性,以期为进一步开发重组hVEGF165蛋白提供理论参考和转基因素材基础。取得的主要研究结果如下:1.hVEGF165转基因家蚕的制作首先,从NCBI下载hVEGF165基因序列（NP001020539.2）,根据家蚕密码子偏好进行密码子优化后直接合成在C末端融合有6×His标签的hVEGF165序列。其次,采用酶切连接方式,将合成序列组装到以家蚕丝胶1基因（Sericin-1,Ser1）启动子为调控元件的亚克隆载体pSL1180[hSer1sp-DsRed-Ser1PA]上,进而再装到piggyBac骨架载体,构建成转基因表达载体pB[hSer1sp-hVEGF165-Ser1PA,3×P3EGFP]（简写为S1-V165）。最后,采用显微注射方法,将S1-V165超纯质粒DNA注射至家蚕早期胚胎,经荧光筛选获得了5个阳性蛾圈;基因组PCR及测序结果表明,转基因蚕制作成功,命名为S1-V165。2.hVEGF165的表达特征解剖获取S1-V165五龄幼虫的中部丝腺进行qRT-PCR检测,结果表明:在五龄第16天的中部丝腺中,hVEGF165的表达量逐渐增加,五龄第6天出现表达峰值,其mRNA含量是内源Ser1 mRNA总量的56%。随后对S1-V165五龄幼虫中部丝腺及茧壳溶解产物进行Western Blot检测,结果显示,在中部丝腺以及茧壳溶解产物中均能检测到目的蛋白,表明重组hVEGF165蛋白已成功在S1-V165家蚕中部丝腺细胞中合成并且分泌进入茧壳中。3.重组hVEGF165蛋白的促细胞增殖活性重组hVEGF165蛋白是否二聚体化是其有无生物学活性的关键。本研究分别利用PBS、8M尿素和弱碱溶液（5 g/L Na2CO3,4 g/L NaHCO3）溶解S1-V165茧壳后进行Western Blot分析,结果表明:在存在或缺乏β-巯基乙醇（还原或非还原条件下）的条件下,重组hVEGF165蛋白分别以单体或二聚体形式存在。紧接着,将灭菌处理的S1-V165茧壳蛋白浓缩液与饥饿处理后的HUVE细胞共培养24 h后,分别进行CCK-8检测及EdU染色分析。结果表明:含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液的促细胞增殖效果显著高于对照组,表明其具有促细胞增殖活性。随后,利用弱碱溶液分别处理细胞0、5、15、30 min后,进行Western Blot分析,结果表明,与对照组相比含有重组hVEGF165蛋白的弱碱溶液处理细胞后对pMAPK44/42的瞬时磷酸化相对较高,具备激活ERK通路从而促进内皮细胞增殖的作用。4.重组hVEGF165蛋白的释放特性取S1-V165茧粉90 mg于3 mL的弱碱液中溶解72 h,采用Western Blot测定弱碱液上清液中重组hVEGF165蛋白的释放行为。结果表明,重组hVEGF165蛋白在024 h内释放速度极快,达到总释放量的80%,2472 h期间仍有少量释放。5.S1-V165茧片的促细胞增殖活性将干燥灭菌的S1-V165茧片浸泡在血清浓度为10%的培养基中,与人脐静脉内皮细胞共同培养24 h后进行观察发现,细胞形态及生长状态良好,与对照组相比无明显死亡;随后利用血清浓度为0.5%的培养基对细胞进行饥饿处理12 h,将茧片放入96孔板中与细胞共同培养72 h,利用CCK-8及EdU染色进行促细胞增殖分析,结果表明,S1-V165茧片处理过的细胞在450 nm处的吸光度显著高于对照组。综上,本研究制作获得了在家蚕中部丝腺特异表达重组hVEGF165蛋白的转基因系统,并在细胞水平证实其具有生物学活性,为进一步探索重组hVEGF165蛋白的开发应用打下了理论及素材基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
•   1.1 概述
•   1.2 家蚕丝腺生物反应器
•     1.2.1 家蚕生物反应器的优势
•     1.2.2 家蚕生物反应器表达系统
•     1.2.3 家蚕转基因表达系统的应用
•   1.3 人血管内皮生长因子
•     1.3.1 人血管内皮生长因子的位置与结构
•     1.3.2 人血管内皮生长因子受体
•     1.3.3 人血管内皮生长因子的外源表达及应用
• 第二章 引言
•   2.1 研究背景及意义
•   2.2 主要研究内容
•   2.3 技术路线
• 第三章 转基因家蚕的制作
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 实验仪器与试剂
•     3.1.3 主要溶液及配制
•     3.1.4 家蚕转基因表达载体的构建
•     3.1.5 显微注射及荧光筛选
•     3.1.6 基因组PCR
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 显微注射和阳性个体筛选
•     3.2.2 转基因表达个体的分子确认
•   3.3 小结与讨论
• 第四章 hVEGF165 的表达特征
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 实验材料
•     4.1.2 主要仪器与试剂
•     4.1.3 主要溶液及配制
•     4.1.4 hVEGF165 基因转录表达检测
•     4.1.5 重组hVEGF165 蛋白的表达检测
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 hVEGF165 基因的转录表达
•     4.2.2 重组hVEGF165 蛋白的表达检测
•   4.3 小结与讨论
• 第五章 重组hVEGF165 蛋白的生物活性分析
•   5.1 材料与方法
•     5.1.1 实验材料
•     5.1.2 主要试剂及仪器
•     5.1.3 主要溶液及配制
•     5.1.4 重组hVEGF165 蛋白的提取与浓缩
•     5.1.5 HUVE细胞培养
•     5.1.6 重组hVEGF165 蛋白促细胞增殖活性
•     5.1.7 重组hVEGF165 蛋白在茧粉中的释放特征分析
•     5.1.8 蚕茧薄片促细胞增殖分析
•   5.2 结果与分析
•     5.2.1 重组hVEGF165 蛋白二聚体检测
•     5.2.2 重组hVEGF165 蛋白的促进细胞增殖活
•     5.2.3 重组hVEGF165 蛋白的释放特征
•     5.2.4 转基因茧片的促细胞增殖活性分析
•   5.3 小结与讨论
• 第六章 总结与结论
• 参考文献
• 硕士在读期间发表文章情况
• 致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张天洋

导师: 徐汉福

关键词: 转基因,家蚕,生物反应器

来源: 西南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西南大学

分类号: Q78;Q963

总页数: 70

文件大小: 2450K

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