导读:本文包含了叁价基因工程疫苗论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:猪伪狂犬病毒,猪博卡病毒,猪细小病毒,重组伪狂犬病毒
叁价基因工程疫苗论文文献综述
薄宗义[1]（2013）在《猪细小病毒—博卡病毒—伪狂犬病毒叁价基因工程疫苗的研究》一文中研究指出疫苗免疫是预防猪病毒性疾病的重要手段,而且随着诊断技术的进步,发现混合感染是猪发病的一种常见形式,因此“一针防多病”是对疫苗研究提出的新要求。已报道利用PRV作为活病毒载体,将外源基因插入到PRV基因组中是多价苗研制的一种重要方法,并且取得了一定的防治效果。PRV和PPV都是导致母猪繁殖障碍性疾病的重要病原,给养猪业造成巨大经济损失。已知PPV对PCV-2导致的PMWS在临床症状表现上具有明显的增强作用,而PBoV'恰好又是在患有PMWS的仔猪中被发现的,同时有报道称PBoV与仔猪呼吸道感染以及仔猪腹泻等症状有关,但关于PBoV在疫苗研制上的研究还是空白。因此,以弱毒株伪狂犬病毒为载体,构建一株可以同时预防PRV、PBoV、PPV的重组病毒,是非常具有研究与应用价值的。而且目前在PBoV的诊断上方法较单一,主要集中在PCR检测,因此本实验还制备PBoV结构蛋白VP2的单克隆抗体,为后续研制PBoV的ELISA诊断试剂盒打下一定基础。1. PBoV结构蛋白VP2单克隆抗体的研制从PBoV阳性病料中成功克隆出VP2基因,并连接到pET-30a载体中,鉴定正确后转化到感受态细胞BL21中诱导表达,发现在48kDa左右处有明显表达条带。纯化后免疫小鼠,对免疫效价予以检测,达到融合要求后与SP2/0融合,经过ELISA, Western-blot等实验筛选,成功获得了4株单克隆抗体。2.叁价重组病毒的构建以TK-/gE-/lacZ+作为亲本毒株,以pIECMV作为中间转移载体。分别将PBoV、PPV的VP2基因以及相对的CMV启动子和PloyA终止子插入到转移载体中,在IBRS-2细胞中共转染重组转移载体以及用EcoR I酶切后的亲本株病毒基因组。36h-54h收获病变细胞,通过PCR检测、空斑实验筛选纯化,成功筛选到重组伪狂犬病毒,Western-blot实验证明PPV、PBoV的VP2蛋白都得到了表达,其中PPV的VP2蛋白约为64kDa, PBoV的VP2蛋白约为62kDa。最后通过测定病毒生长曲线以及连续传代培养等实验证明外源基因的插入并没有影响PRV的增殖。3.叁价重组病毒的免疫效果评估分别将105.0TCID50的亲本株病毒、重组病毒以及同体积的MEM免疫小鼠,首免后第四周二免,分别采集0、14、28、42、56天的血清进行ELISA抗体水平检测以及PRV中和抗体水平检测。发现实验组可以诱导小鼠产生针对PPV和PBoV的ELISA抗体；在PRV中和抗体结果上,重组病毒组与亲本株病毒组相近。(本文来源于《华中农业大学》期刊2013-06-01）
聂浩[2]（2010）在《弓形虫—伪狂犬病毒重组二价基因工程疫苗研究》一文中研究指出弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的、在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。猫是弓形虫的终末宿主,会排出感染性的卵囊,卵囊被认为是弓形虫感染的主要来源之一。人经食物、饮水等途径摄入卵囊而感染。不过,也有越来越多的研究将目光关注于人通过食用含有T. gondii组织包囊的肉及肉制品而感染弓形虫的风险。免疫预防是控制弓形虫病的主要手段,但由于弓形虫复杂的生活史中有着多种多样的因素对弓形虫免疫产生影响,目前弓形虫的免疫预防研究进展不大。在弓形虫病诊断方面,尽管已有很多方法用于弓形虫的检测,但在临床实际应用中缺乏操作简便、快速且不需要昂贵仪器的病原学诊断方法。为此本研究对T. gondii LAMP病原学诊断方法及T. gondii-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究结果如下：1.弓形虫LAMP检测方法的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由日本学者Notomi于2000年发明的一种新型体外恒温核酸扩增方法,主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在等温条件下进行高效扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成。目前,该技术已被广泛应用于病毒、细菌、动物原虫等疾病的检测。本研究中,我们针对弓形虫MIC3基因(GeneBank No. EU572718)设计了一组引物,包括有内引物对、外引物对以及促环引物对,通过一系列反应条件的筛选建立了弓形虫LAMP病原诊断方法。敏感性实验结果表明该方法能检测到的极限值为0.4个速殖子,特异性实验结果表明该方法具有特异性强的特点。利用该方法和B1-based Nested-PCR同时检测320份临床采集的猪的血液和组织样品,其阳性检出率分别为11.6%和9.69%,说明LAMP方法更为敏感。另外利用该方法检测猪肉样品中弓形虫的感染,在某屠宰场的45份样品中检测出9份阳性,而在5个市场收集的68份样品检出3份阳性,这些结果说明,猪肉中弓形虫感染的风险是切实存在的。上述结果表明基于弓形虫MIC3基因的LAMP诊断方法具有敏感性高、特异性强的特点,加上该方法具有操作省时、省力,不需要昂贵的仪器,因此具有很好的推广应用前景。2.表达弓形虫SAG1、MIC3和GRA7基因的重组伪狂犬病病毒的构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)是一种能引起多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的病毒,由该病毒引起的猪伪狂犬病是目前危害全球养猪业的主要传染病之一。伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗是目前应用最为成功的动物标志疫苗之一,同时也是良好的基因工程重组疫苗载体,迄今为止,已有几十种外源基因在PRV中得到表达。本研究中,分别将经PCR方法扩增的SAG1、MIC3和GRA7全基因插入到PRV gG-缺失通用转移载体pgG-Uni的多克隆位点中以构建转移质粒pgG-SAG1、pgG-MIC3和pgG-GRA7。然后再将上述质粒与PRV TK-/gG-/EGFP+基因组共转染IBRS-2细胞,病变后经空斑纯化得到重组病毒TK-/gG-/ SAG1(MIC3,GRA7)+。通过Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达。结果表明重组病毒构建正确,且外源基因得到了正确表达。重组病毒的TCID50测定结果表明,外源基因的插入不影响重组病毒在IBRS-2细胞上的增殖。重组病毒传代30代后外源基因仍然存在,同时以不同剂量接种实验动物没有出现毒力增强现象,这些结果说明重组病毒具有很好的遗传稳定性和安全性。3.重组病毒作为疫苗的免疫效果及保护力利用构建的叁株重组病毒单独或联合免疫小鼠,所有接种重组病毒的小鼠都产生对弓形虫裂解抗原(TLA)特异性的抗体,伴随着很强的淋巴细胞增殖反应,并且IFN-γ和IL-2的量明显上升。这些结果说明重组伪狂犬病毒能够诱导产生很强的体液免疫和Th1型的细胞免疫。免疫攻击实验结果表明重组伪狂犬病毒免疫后能使小鼠产生抵抗致死性RH株弓形虫攻击的保护力,明显延长攻虫小鼠的存活时间,并同时诱导产生较高水平PRV中和抗体和抵抗致死性PRV的攻击。而那些用两株和叁株rPRV混合免疫的小鼠能够产生更高水平的T. gondii-specific IgG抗体、更强的淋巴细胞增殖反应,并且更有效的抵抗弓形虫的攻击。这些结果说明表达弓形虫保护性抗原的重组伪狂犬病毒具备开发成为一种新型疫苗的潜力,可用来同时预防动物伪狂犬病和弓形虫病。(本文来源于《华中农业大学》期刊2010-05-01）
满晓营[3]（2009）在《猪水肿病与仔猪副伤寒二价基因工程疫苗研究》一文中研究指出猪水肿病是由特定血清型产类志贺氏毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichiacoli,SLTEC)引起猪的一种急性、致死性传染病,发病率低,但病死率高,幸存者发育迟缓,饲料回报率低,给养猪业带来很大的经济损失。猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原,过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一,现在在我国特别是农村散养户普遍存在,造成一定经济损失。产类志贺毒素大肠杆菌的两个主要毒力因子是F18ab菌毛与类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)。编码F18ab的基因有6个:fedA、fedB、fedC、fedD、fedE和fedF。Smeds A等(2001)利用融合蛋白对F18菌毛粘附特性作了进一步的研究,表明纯化的FedF与细菌的粘附相关。SLT-Ⅱe毒素是由一个A亚基和5个B亚基共同组成的聚合体。SLT-Ⅱe的B亚基没有毒性,而具有免疫原性,是水肿病毒素的主要保护性抗原。沙门氏菌作为疫苗活载体己受到学界的广泛重视,其主要优点包括沙门氏菌可以经口服或鼻内途径免疫,操作方便,对接种对象应激小。此外,沙门氏菌为胞内侵袭细菌,可以有效呈递抗原,并激发抗沙门氏菌和诱导外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应,并能同时诱导粘膜免疫与全身免疫。基于以上原因,希望构建以沙门氏菌作为载体表达融合基因SLT-ⅡeB与FedF,得到一种疫苗可以同时预防仔猪水肿病和沙门氏菌病。主要研究内容包括:1、重组质粒pYA-SF的构建参照GenBank中大肠杆菌EC0412A株SLT-ⅡeB和FedF序列设计引物,以WH3基因组为模板扩增并克隆SLT-ⅡeB与FedF基因,扩增片段大小为204bp和840bp,前者引物引入EcoRI和SalⅠ酶切位点,后者引入SalⅠ和HindⅢ酶切位点。回收PCR产物,连接pMD18-T,得到质粒pMD18-SLT-ⅡeB-FedF,用EcoRⅠ和HindⅢ分别对质粒pMD-SLT-ⅡeB-FedF和pYA3493双酶切,回收、连接、转化Asd~-大肠杆菌x6097,得到质粒pYA-SLT-ⅡeB-FedF(缩写为pYA-SF)。2、重组菌株C501(pYA-SF)的构建与鉴定将重组平衡表达质粒pYA-SF电转化△asdC500缺失株,在无DAP的LB平板上筛选阳性重组子。用引物pa7/pa6对重组菌株进行鉴定,可以扩增出△asd缺失型菌株的2,229 bp片段,而亲本菌C500则扩增出4,000 bp的片段;引物ps1/ps2扩增出SLT-ⅡeB特异性片段204 bp,引物pf1/pf2扩增出FedF特异性片段840 bp,而亲本菌C500则不能扩增出该两种片段。结果表明获得含有pYA-SF质粒的重组菌株是正确的。3、重组菌株生物学特性的研究表型研究与生化特性研究表明重组菌株C501(pYA-SF)与亲本株C500相同。生长曲线得出C501(pYA-SF)生长速度与亲本菌株C500相似,而比C500缺失菌株△asdC500(pYA3493)的生长速度稍快。遗传特性研究表明重组菌株可以稳定遗传。SDS-PAGE结果显示,重组菌株可以分泌表达,因为重组菌株C501(pYA-SLT-ⅡeB-FedF)在约37kDa处有明显的表达带,而空载体对照菌株C501(pYA3493)则没有对应的表达带。4、基因工程疫苗对小鼠的免疫保护效力研究皮下免疫小鼠,每周采集小鼠血清,利用间接ELISA检测所有免疫组的IgG抗体,结果表明针对相应抗原的抗体相应增加,加强免疫后抗体平均水平进一步提高。小鼠免疫后30天,分别用猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(1×10~(7.1) CFU)口服攻毒和猪水肿病大肠杆菌强毒株WH3(5×10~8 CFU)腹腔攻毒,亲本菌株C500组和重组菌株免疫组小鼠抵抗10×LD_(50)的猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的攻击,而PBS对照组小鼠全部死亡,然而重组菌株免疫组和水肿病叁价灭活苗组对2.5×LD_(50)大肠杆菌强毒株WH3的攻击差别比较大,重组菌株免疫组只能提供43%的保护率,灭活苗组却能提供89%的保护率,同期的PBS对照组小鼠全部死亡。5、基因工程疫苗对猪的免疫保护力研究重组菌株的安全性试验结果发现所有C500(pYA-SF)肌肉注射接种组仔猪的精神食欲正常,未见异常变化。亲本菌株C500接种的仔猪,也没有异常临床表现。将6×10~9 CFU重组菌株C501(pYA-SF)分别通过肌肉注射途径免疫20日龄仔猪,结果显示免疫仔猪能产生较高水平的抗沙门氏菌和SLTEC重组蛋白rSF的血清IgG,并能抵抗5×LD_(50)猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1的耳静脉攻击(4/4)。同时,免疫仔猪也能抵抗SLTEC强毒株WH3分泌毒素的耳静脉攻毒途径的攻击(3/4),而PBS组(0/4)和C501(pYA3493)载体对照组(1/4)均不能提供有效保护。说明研究构建的猪水肿病与仔猪副伤寒重组二价活疫苗株C501(pYA-SF)能保护免疫仔猪抵抗猪霍乱沙门氏菌和SLTEC的攻击,有望成为实用有效的二价活疫苗株。(本文来源于《华中农业大学》期刊2009-06-01）
陈关平[4]（2008）在《O型口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究》一文中研究指出口蹄疫(Foot and Mouth Disease FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and Mouth DiseaseVirus FMDV)引起的偶蹄动物急性、热性、高度接触性传染病,是危害畜牧业最严重的传染病之一,也是造成家畜及其产品国际贸易受阻的重要疾病,被国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)在国际动物卫生法典中列为18种A类传染病之一,近年又被列为重大跨国动物疫病的全球消灭计划及生物武器安全公约组织重点检查对象。中国政府公布的《动物病原微生物分类明录》将口蹄疫病毒列为十种一类动物病原微生物之一。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus),有七个血清型,分别为A、O、C、Asia1和南非SAT1、SAT2、SAT3,每种血清型里又可分为许多亚型,不同血清型之间没有交叉保护力,其中O型口蹄疫分布最广,在非洲、南亚、中东和南美许多国家广泛分布,在我国的口蹄疫病例大多都是O型口蹄疫。免疫预防接种是控制乃至消灭口蹄疫的主要措施,目前使用O型口蹄疫灭活疫苗预防该病,取得了一定的效果,但是仍需改进。本研究以伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因缺失株TK~-/gE~-/LacZ~+为载体,融合表达具有免疫增强作用的牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型FMDV的主要抗原基因P1或P1/2A/3C,构建了基因工程二价疫苗株,达到一针预防两种疾病的目的。同时以pcDNA3.1(+)为载体构建了DNA疫苗pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C。用Balb/c小鼠模型比较了重组病毒TK/gE/VP22-P1、TK~-/gE~-/VP22-P1/2A/3C和DNA疫苗pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C及猪口蹄疫O型灭活疫苗的免疫效果。1.牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因、O型口蹄疫病毒P1和P1/2A/3C基因的克隆与序列分析为了将VP22基因分别与FMDV的P1基因和P1/2A/3C基因的5'端按照正确的阅读框架融合,首先设计一对分别含有HindⅢ和EcoRⅤ酶切位点的上、下游引物,从含有牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因的重组质粒中扩增出不含终止密码子的牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因编码区;再用分别含有EcoRV和XbaⅠ酶切位点的上、下游引物,从含有O型FMDV P1基因和P1/2A/3C基因的重组质粒中分别扩增出不含起始密码子的P1基因和P1/2A/3C基因;将扩增的VP22基因、P1基因和P1/2A/3C基因,分别克隆到pMD18-T载体,获得重组质粒pMD18-T-VP22、pMD18-T-P1和pMD18-T-P1/2A/3C。DNA测序结果表明,叁个基因的序列与已经公布的序列完全一致。2.共表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒主要免疫原性基因的DNA疫苗的构建及其免疫原性的效果用HindⅢ和EcoRⅤ酶切pMD18-T-VP22后,凝胶回收VP22基因,并定向克碌秸婧吮泶镏柿cDNA3.1(+)的HindⅢ和EcoRⅤ酶切位点之间,获得重组质粒pcDNA-VP22;将pMD18-Y-P1和pMD18-T-P1/2A/3C分别用EcoRⅤ和XbaⅠ酶切后凝胶回收,回收片段分别定向克隆到pcDNA-VP22的EcoRⅤ和XbaⅠ酶切位点之间,使其与VP22的3'端融合,分别获得重组表达质粒pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C。然后用Balb/c小鼠模型评价了pcDNA-VP22-P1和pcDNA-VP22-P1/2A/3C两种DNA疫苗及本实验室以前构建的不含VP22的DNA疫苗pcDNA-P1和pcDNA-P1/2A/3C的免疫效果。结果显示,首免后14天和28天,四种DNA疫苗均产生了可以检测到的FMDV ELISA抗体和中和抗体;含VP22的DNA疫苗(pcDNA-VP22-P1、pcDNA-VP22-P1/2A/3C)的抗体水平在二免后显着高于不含VP22的DNA疫苗(pcDNA-P1、pcDNA-P1/2A/3C)(P＜0.05);DNA疫苗与FMDV灭活疫苗联合免疫的抗体水平显着高于DNA疫苗单独免疫(P＜0.05),但与FMDV灭活疫苗单独免疫没有显着差异(P＞0.05)。淋巴细胞增殖试验结果显示,DNA疫苗诱导细胞免疫的水平远远高于FMDV灭活疫苗(P＜0.05)。3.共表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因和O型口蹄疫病毒多抗原表位的重组伪狂犬病毒的构建及其免疫应答利用通用转移载体pIECMV,构建了转移载体pIECMV-VP22-P1和pIECMV-VP22-P1/2A/3C。以PRV TK~-/gE~-/LacZ~+为亲本株,分别构建了融合表达VP22-P1和VP22-P1/2A/3C的重组病毒TK~-/gE~-/VP22-P1和TK~-/gE~-/VP22-P1/2A/3C,经空斑纯化、PCR和Southern杂交鉴定,获得了纯化的病毒。Western blot证实VP22-P1和VP22-P1/2A/3C在重组伪狂犬病毒中得到表达。检测了重组病毒的遗传稳定性和增殖滴度。用该重组病毒免疫Balb/c小鼠,并与亲本株和O型口蹄疫灭活苗进行比较。结果显示,无论是TK~-/gE~-/VP22-P1疫苗免疫组,还是TK~-/gE~-/VP22-P1/2A/3C疫苗免疫组,其FMDV的ELISA抗体水平均与FMDV灭活疫苗免疫组的抗体水平相当,显着不差异(P＞0.05),说明利用伪狂犬病毒融合表达VP22-P1和VP22-P1/2A/3C能激发很好的免疫反应。综上所述,本研究成功构建了融合表达牛疱疹病毒Ⅰ型VP22基因与O型口蹄疫病毒P1基因或P1/2A/3C基因的DNA疫苗和重组伪狂犬病毒重组疫苗,并利用Balb/c小鼠为模型对不同疫苗的免疫原性进行了比较,为口蹄疫新型疫苗的研究提供了基础。(本文来源于《华中农业大学》期刊2008-05-01）
马鸣潇[5]（2007）在《FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究》一文中研究指出为了对FMDV致病分子机制和新型疫苗的研究奠定基础,本研究成功克隆到了O/LZ株FMDV除poly(C)和poly(A)外的整个基因组,并对其分子背景进行分析;在此基础上完成了O/LZ株FMDV的拯救。为了研制适合于不同血清型、不同流行株FMDV的广谱、高效和廉价的新型疫苗,选择O型、A型FMDV VP1基因和AsiaI型FMDV的两个基因拓扑型的VP1基因上的主要抗原表位基因为主免疫原基因,以FMDV非结构蛋白及结构蛋白上的Th2细胞表位基因作为辅助基因,设计和构建FMDV复合多表位免疫原基因表达盒OAAT,通过计算机软件模拟分析,理论上符合预期要求。以OAAT为目的基因进行原核表达,目的蛋白以包涵体的形式获得高效表达。以OAAT为目的基因,并辅以SEA和IL-18作为基因佐剂,构建了FMDV叁价DNA疫苗和鸡痘病毒重组载体活疫苗;小鼠免疫试验结果表明,OAAT具有良好的免疫原性,SEA和IL-18有可能在未来成为有效的基因佐剂,且采用prime-boost免疫策略,免疫效果更佳。(本文来源于《吉林大学》期刊2007-06-01）
李双斌[6]（2007）在《以伪狂犬病毒为载体的二价基因工程疫苗免疫效力评价》一文中研究指出在现行养猪生产中，猪伪狂犬病(PR)，猪口蹄疫(FMD)，猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)，猪乙脑(JE)是几种常见的流行病，也是猪群重要防疫的几种传染病，其危害在大规模化养殖中越来越大。这四种病在日常的防疫中是必不可少的免疫预防疾病，如果能够同时预防好这四种疾病，在养猪生产中即可获得相当的成功，但由于各地的疫苗质量不一样，免疫效力也难以相同，特别是国外进口疫苗的冲击，其质量和效益对养猪生产带来很大的困惑。由华中农大已经研制成熟的伪狂犬病毒基因工程疫苗在我国伪狂太病的预防和净化上起了重要的作用。另外，伪狂犬病毒也是一个十分优良的重组疫苗载体，由华中农大动物传染病研究室研制成功的以伪狂犬病毒为载体的二价基因工程疫苗为解决生产实际的问题提供了很好的手段，其理论上的成熟，以及在实际应用中的效果，都为当前养猪疾病预防和控制提供了新的方法。本试验将分别以rPRV-JEV，rPRV-PRRSV和rPRV-FMDV叁种重组疫苗免疫PRV，JEV，PRRSV，FMDV阴性的40-50日龄的叁元仔猪，检测免疫猪只的抗体水平。通过本试验，可以证明以PRV为载本的二价基因工程疫苗其免疫效力达到或优于同类单联苗，为实际生产中应用疫苗提供了选择依据。(本文来源于《华中农业大学》期刊2007-06-01）
宋云峰[7]（2006）在《猪2型圆环病毒核酸疫苗及重组伪狂犬病毒二价基因工程疫苗的研究》一文中研究指出猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，而且也与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性震擅、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从19世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此用现代基因工程手段构建的第二代新型疫苗，必然在该病毒的防制上具有重要作用。本研究以编码PCV2核衣壳蛋白的ORF2基因为研究对象，实现了ORF2基因在真核细胞中的表达，并进一步将ORF2基因插入核酸疫苗载体构建了ORF2基因的核酸疫苗和“自杀性”DNA疫苗；同时将具有蛋白转导功能的BVP22基因与ORF2基因在核酸疫苗和“自杀性”DNA疫苗中融合表达，通过蛋白转导增强疫苗的免疫效应；以伪狂犬病毒弱毒株TK/gE/LacZ~+为亲本毒，构建了表达ORF2基因的重组伪狂犬病毒TK儋E/ORF2~+；同时对构建的PCV2疫苗进行了动物试验，以探索一种可用于PCV2防制的新型疫苗。1．PCV2 ORF2及BHV-1 VP22基因在真核细胞中的表达及定位研究通过PCR方法扩增PCV2 ORF2基因和BHV-1 VP22基因，将扩增的基因连入T载体克隆测序后，用HindⅢ和BglⅡ双酶切将ORF2基因切下，连入pEGFP-N1载体的HindⅢ肌和BamHⅠ双酶切位点，得到ORF2基因的真核表达质粒pNORF2。用BamHⅠ和BglⅡ将BVP22基因从T载体上切下，连入pEGFP-NI载体的BamHⅠ位点，得到BVP22基因的真核表达质粒pNBVP22。通过脂质体转染的方法，将pEGFP-N1、pNORF2和pNBVP22质粒分别转染到Hela细胞中，转染18 h后在倒置荧光显微镜下观察荧光，可见转染pNORF2的Hela细胞有绿色荧光表达，且明显分布于核周，转染pNBVP22的细胞也有荧光表达，荧光主要分布于核周，而在细胞质中也发现有大量的荧光，转染pEGFP-N1的细胞则在整个细胞都可见散在荧光。以上结果说明了我们克隆的ORF2基因、BVP22基因在真核细胞中成功表达，为基因工程疫苗的研究奠定了基础。2．PCV2核酸疫苗的构建、免疫效应研究，以及BVP22基因免疫增强效应研究PCR扩增PCV2 ORF2和BVP22基因，将ORF2基因克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+)，构建了PCV2的核酸疫苗pCORF2，同时分别将具有蛋白转导功能的BVP22基因分别克隆到ORF2基因的上游和下游，使二者融合表达，构建pCORF2BVP22、pCBVP22ORF2质粒。将上述质粒以及空载体pCDNA3.1肌肉免疫BALB/c小白鼠，共免疫2次，间隔2周，分别于首免后2周和二免后4周采血，用ELISA法检测体液抗体。实验结果显示，通过两次免疫后，加入蛋白转导的核酸疫苗组产生了PCV2特异性抗体，而单独用ORF2基因构建的核酸疫苗的免疫原性比较弱，证明BVP22可增强核酸疫苗的免疫效果，其中以BVP22在ORF2上游效果更好，可作为PCV2防制的一种候选疫苗3．PCV2“自杀性”DNA疫苗的构建、免疫效应研究，以及BVP22在“自杀性”DNA疫苗中的免增强效应研究将PCV2 ORF2基因克隆到“自杀性”DNA疫苗载体pSCA1和pSHAME2a，构建了ORF2的“自杀性”DNA疫苗pSORF2和pMORF2。进一步将BVP22基因插入ORF2基因的上游，构建了pSBVP22ORF2、pMBVP22ORF2“自杀性”DNA疫苗载体。肌肉注射免疫BALB/c小白鼠，首免后2周加强免疫一次，分别于首免后2周和6周采血，用ELISA方法检测血清体液抗体水平。从ELISA检测结果可以看出，一次免疫后2周即可刺激小白鼠产生针对PCV2的特异性体液抗体，而BVP22蛋白转导的效果在“自杀性”DNA疫苗中的效果并不明显。4．表达PCV2 ORF2基因的重组伪狂犬疫苗毒株的构建将ORF2基因插入伪狂犬病毒重组转移载体plECMV，构建ORF2基因的重组转移质粒pIEORF2。用EcoRⅠ酶切伪狂犬病毒疫苗株Tk~-/gE~-/LacZ~+基因组，与重组转移质粒pIEORF2共转染IBRS-2细胞。收集病变细胞，经空斑纯化和PCR筛选，获得了新的重组病毒Tk~-/gETORF2~+。Southern blotting杂交结果显示，ORF2基因插入了PRV基因组预期的位置，用间接免疫荧光法和Western blotting杂交方法证明了插入的基因可在该重组病毒中进行表达。同时该病毒在IBRS-2细胞上连续传代15代后遗传稳定。该重组病毒在各种细胞上增殖滴度高，在IBRS-2细胞上增殖滴度为10~(-7.1)TCID_(50)/0.1mL，在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10~(-4.8)TCID_(50)/0.1mL，在Marc-145细胞上增殖滴度为10~(-6.8)TCID_(50)/0.1mL。5．PCV2-PRV重组二价基因工程疫苗的免疫效应研究用上述构建的伪狂犬重组病毒疫苗株Tk~-／gE~-／ORF2~+免疫28日龄左右断奶仔猪5头，作为对照同时用伪狂犬基因缺失病毒疫苗株Tk~-／gE~-／gI~-免疫28日龄断奶仔猪5头，空白对照3头注射2 mL DMEM。首免后3周加强免疫一次，在首免后0，21，35，49天采血，用ELISA和中和试验的方法检测血清中的PRV和PCV2抗体，在第49天检测PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。试验结果显示，用Tk~-/gE~-／ORF2~+、Tk~-／gE~-／gI~-免疫猪在免疫后21天即可检测到抗伪狂犬病毒的中和抗体和ELISA抗体，在加强免疫后抗体滴度继续升高。ORF2 ELSIA检测的结果显示在Tk~-／gE~-／ORF2~+免疫后21天，有的仔猪体内已有PCV2抗体产生，但是滴度都不高，在加强免疫后可见所有免疫仔猪发生PCV2的血清阳转。淋巴细胞增殖试验结果证实，Tk~-／gE~-／ORF2~+可激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。(本文来源于《华中农业大学》期刊2006-12-01）
卫广森,陆承平,陈溥言[8]（2006）在《新生仔猪大肠埃希氏菌性腹泻K_(88)ac-ST_1-LT_B叁价基因工程灭活疫苗生产工艺的研究》一文中研究指出以实验室工艺为基础,用发酵罐培养,对培养基、诱导剂及诱导条件、通气量、菌液灭活条件等进行了筛选优化。结果表明,重组菌株BL21(DE3)(pXK88acST3LT5)培养的最适培养基为改良LB培养基;乳糖为适合于工业化生产的诱导剂,其最适浓度为100 mmol/L,诱导时间不低于6 h;2×105mL发酵罐培养的最佳通气量为500 L/min;培养菌液的灭活条件为按菌液总量加入4 mL/L甲醛溶液,37℃灭活48 h。按上述工业化生产条件生产疫苗5批,检验结果均安全有效。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2006年09期）
王云峰[9]（2006）在《鸡痘病毒载体多价基因工程疫苗及禽流感等亚单位疫苗研制》一文中研究指出一、项目简介及技术创新该项目主要是应用我国动物疫病及免疫预防中的问题,迫切需要用更新、更好、效率更高的疫苗来完善疫病防制体系,最终达到净化的目的而确定的。为了研制与现有常规疫苗免疫保护效果更加安全的鸡痘病毒活载体疫苗及其相配套的鉴别诊断技术,我们主要选择(本文来源于《中国农村科技》期刊2006年08期）
王新[10]（2006）在《猪2型圆环病毒、猪细小病毒核酸疫苗及猪2型圆环—猪细小—伪狂犬病叁价基因工程疫苗研究》一文中研究指出猪圆环病毒病、猪细小病毒病与伪狂犬病是危害全球养猪业的叁种重要传染病，分别由猪圆环病毒2型(porcine Circovius Type 2，PCV2)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)引起。目前这叁种传染病在猪场并发或继发感染现象较为普遍，给养猪业造成了巨大的经济损失，因此，为了预防和控制这些疾病，安全、高效的疫苗是首要的解决途径。伪狂犬病毒是一个重要的活病毒载体，具有不感染人、基因组容量大、重组病毒遗传稳定等特点，外源基因可稳定地插入其DNA。因此以伪狂犬病毒基因缺失株为表达载体，将其它病原的保护性抗原基因插入到PRV基因缺失疫苗株中，构建二价或多价基因工程疫苗，可以起到对多种疾病的预防作用。本文分别对PCV2和PPV核酸疫苗及PCV2-PPV-PRV叁价基因工程疫苗进行了研究，其主要研究内容如下：1．ORF2基因和VP2基因在哺乳动物细胞中的表达将PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因酶切分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1+中，筛选重组质粒，分别命名为pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2。然后再将pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2采用脂质体法转染IBRS-2细胞，36小时后收集转染的细胞处理后，经Western blotting检测，结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2质粒转染的IBRS-2细胞分别在29kD和64kD处出现特异性反应带；而同步转染的pcDNA3.1(+)对照却未出现特异性带，从而表明重组的核酸质粒pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2构建成功，并在哺乳动物细胞中获得表达。2．ORF2基因和VP2基因核酸疫苗对小鼠的免疫原性及其安全性试验将猪圆环病毒2型ORF2基因疫苗和猪细小病毒VP2基因疫苗分别肌注免疫Balb／c小鼠两次，于首免后第14天和第56天采血，作间接ELISA抗体检测试验；检测结果显示重组的核酸疫苗都能诱导小鼠机体分别产生抗PCV和抗PPV特异性抗体。于首免后第56天，采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)，和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测。淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示构建的pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫组小鼠的脾淋巴细胞经刀豆素A(ConA)刺激后，其淋巴细胞转化率(刺激指数)分别为1.57和1.68，明显高于PBS空白对照组(刺激指数为1)和pcDNA-3.1(+)组(刺激指数为1.04)，但是低于PPV活疫苗组(刺激指数为1.76)和PCV2活疫苗组(刺激指数为1.69)；而T细胞亚类数量的检测结果显示pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2免疫的各试验组小鼠的外周血T淋巴细胞亚类CD8~+的数量显着增加，而CD4~+的数量却减少。这些结果表明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗均能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。提取小鼠各组织器官染色体基因组进行PCR扩增，对基因疫苗的安全性进行检测，结果显示未能从免疫小鼠各组织的基因组扩增出ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2和VP2基因未整合到小鼠染色体上，说明pcDNA-ORF2和pcDNA-VP2核酸疫苗是安全的。3．表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因的重组伪狂犬病病毒的构建将PCV2的ORF2基因和PPV的VP2基因酶切依次插入到PRV gI基因缺失通用转移载体pPI-2.EGFP的多克隆位点中，构建转移质粒pPI-2.EGFP.ORF2.VP2。然后再将该质粒与PRV基因缺失株SA215基因组共转染ST细胞，通过同源重组，构建了融合表达PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的重组伪狂犬病毒株，命名为SA215(D)。经荧光检测和PCR、Southern转印杂交鉴定，结果表明SA215(D)构建成功；并通过SDS-PAGE电泳和Western免疫印迹检测表明PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因在重组病毒内获得表达，产生大小约120kD的融合蛋白，而融合蛋白中的PCV2 ORF2基因、PPV VP2基因蛋白都仍然保持了原有的免疫原性。此外，SA215(D)株在Vero、IBRS-2、ST和CEF细胞中的增殖滴度与亲本株SA215相比无显着差异，表明外源基因的插入不影响病毒增殖。4．重组伪狂犬病病毒SA215(D)的形态学和遗传稳定性研究将PRV基因缺失株和获得的重组病毒SA215(D)的ST细胞培养物进行扫描电镜观察，均能观察到PRV典型的病毒粒子存在，两者形态上无大的差异，表明外源基因的插入不影响病毒的形态。另外，重组病毒SA215(D)在Vero细胞上连续传7代后，分别用VP2基因和ORF2基因的扩增引物进行PCR鉴定，结果均能扩增到ORF2基因和VP2基因片段，表明ORF2基因和VP2基因片段己被稳定地插入到重组伪狂犬病毒SA215(D)基因组中，并具有遗传稳定性。5．PCV2-PPV-PRV叁价基因工程疫苗对小鼠的免疫原性和安全性试验将重组伪狂犬病毒SA215(D)制成PCV2-PPV-PRV叁价基因工程疫苗接种小鼠，并对该工程疫苗的免疫原性和安全性进行研究。小鼠安全性试验显示将重组重组伪狂犬病毒SA215(D)株，PRV SA215株和野毒Fa株分别以10~4和10~5PFU剂量接种小鼠，结果接种Fa株小鼠全部死亡，而接种SA215(D)和SA215株的小鼠全部存活；另外，将这叁组免疫小鼠的组织器官进行病理切片观察，结果接种Fa株小鼠的组织病变比SA215(D)和SA215株的严重，而接种SA215(D)和SA215株小鼠的组织病变比较接近。这些结果表明SA215(D)株的毒力显着低于野毒株，而与亲本株SA215相近，初步验证了该重组病毒的安全性。将PCV2-PPV-PRV叁价基因工程疫苗加强免疫小鼠后，作间接ELISA抗体检测试验，结果显示SA215(D)能诱导小鼠产生较高的抗PRV，PCV2和PPV的抗体水平，其中抗PRV中和抗体与其亲本株SA215抗体水平相当，能完全抵抗致死剂量PRV强毒的攻击，具有与亲本株疫苗相当的免疫保护效果；淋巴细胞增殖试验(MTT法)结果显示SA215(D)能诱导小鼠脾淋巴细胞的增殖；而T细胞亚类数量的检测结果显示SA215(D)免疫小鼠能有效提高T细胞数量，增强小鼠的免疫水平。这些结果表明重组伪狂犬病毒SA215(D)制成的PCV2-PPV-PRV叁价基因工程疫苗能成功诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答。重组病毒对PRV Fa株在体内定植特性研究显示免疫重组病毒SA215(D)可以抵御PRV Fa株在小鼠中的定植。以上结果表明重组病毒SA215(D)可以作为预防猪2型圆环病毒、猪细小病毒和伪狂犬病的叁价基因工程疫苗候选株。(本文来源于《四川农业大学》期刊2006-06-03）
叁价基因工程疫苗论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
弓形虫病(Toxoplasmosis)是由刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的、在世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病。猫是弓形虫的终末宿主,会排出感染性的卵囊,卵囊被认为是弓形虫感染的主要来源之一。人经食物、饮水等途径摄入卵囊而感染。不过,也有越来越多的研究将目光关注于人通过食用含有T. gondii组织包囊的肉及肉制品而感染弓形虫的风险。免疫预防是控制弓形虫病的主要手段,但由于弓形虫复杂的生活史中有着多种多样的因素对弓形虫免疫产生影响,目前弓形虫的免疫预防研究进展不大。在弓形虫病诊断方面,尽管已有很多方法用于弓形虫的检测,但在临床实际应用中缺乏操作简便、快速且不需要昂贵仪器的病原学诊断方法。为此本研究对T. gondii LAMP病原学诊断方法及T. gondii-PRV二价基因工程疫苗进行了研究,主要研究结果如下：1.弓形虫LAMP检测方法的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由日本学者Notomi于2000年发明的一种新型体外恒温核酸扩增方法,主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域,在等温条件下进行高效扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成。目前,该技术已被广泛应用于病毒、细菌、动物原虫等疾病的检测。本研究中,我们针对弓形虫MIC3基因(GeneBank No. EU572718)设计了一组引物,包括有内引物对、外引物对以及促环引物对,通过一系列反应条件的筛选建立了弓形虫LAMP病原诊断方法。敏感性实验结果表明该方法能检测到的极限值为0.4个速殖子,特异性实验结果表明该方法具有特异性强的特点。利用该方法和B1-based Nested-PCR同时检测320份临床采集的猪的血液和组织样品,其阳性检出率分别为11.6%和9.69%,说明LAMP方法更为敏感。另外利用该方法检测猪肉样品中弓形虫的感染,在某屠宰场的45份样品中检测出9份阳性,而在5个市场收集的68份样品检出3份阳性,这些结果说明,猪肉中弓形虫感染的风险是切实存在的。上述结果表明基于弓形虫MIC3基因的LAMP诊断方法具有敏感性高、特异性强的特点,加上该方法具有操作省时、省力,不需要昂贵的仪器,因此具有很好的推广应用前景。2.表达弓形虫SAG1、MIC3和GRA7基因的重组伪狂犬病病毒的构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)是一种能引起多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的病毒,由该病毒引起的猪伪狂犬病是目前危害全球养猪业的主要传染病之一。伪狂犬病病毒基因缺失标志疫苗是目前应用最为成功的动物标志疫苗之一,同时也是良好的基因工程重组疫苗载体,迄今为止,已有几十种外源基因在PRV中得到表达。本研究中,分别将经PCR方法扩增的SAG1、MIC3和GRA7全基因插入到PRV gG-缺失通用转移载体pgG-Uni的多克隆位点中以构建转移质粒pgG-SAG1、pgG-MIC3和pgG-GRA7。然后再将上述质粒与PRV TK-/gG-/EGFP+基因组共转染IBRS-2细胞,病变后经空斑纯化得到重组病毒TK-/gG-/ SAG1(MIC3,GRA7)+。通过Western blotting检测重组病毒中外源基因的表达。结果表明重组病毒构建正确,且外源基因得到了正确表达。重组病毒的TCID50测定结果表明,外源基因的插入不影响重组病毒在IBRS-2细胞上的增殖。重组病毒传代30代后外源基因仍然存在,同时以不同剂量接种实验动物没有出现毒力增强现象,这些结果说明重组病毒具有很好的遗传稳定性和安全性。3.重组病毒作为疫苗的免疫效果及保护力利用构建的叁株重组病毒单独或联合免疫小鼠,所有接种重组病毒的小鼠都产生对弓形虫裂解抗原(TLA)特异性的抗体,伴随着很强的淋巴细胞增殖反应,并且IFN-γ和IL-2的量明显上升。这些结果说明重组伪狂犬病毒能够诱导产生很强的体液免疫和Th1型的细胞免疫。免疫攻击实验结果表明重组伪狂犬病毒免疫后能使小鼠产生抵抗致死性RH株弓形虫攻击的保护力,明显延长攻虫小鼠的存活时间,并同时诱导产生较高水平PRV中和抗体和抵抗致死性PRV的攻击。而那些用两株和叁株rPRV混合免疫的小鼠能够产生更高水平的T. gondii-specific IgG抗体、更强的淋巴细胞增殖反应,并且更有效的抵抗弓形虫的攻击。这些结果说明表达弓形虫保护性抗原的重组伪狂犬病毒具备开发成为一种新型疫苗的潜力,可用来同时预防动物伪狂犬病和弓形虫病。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
叁价基因工程疫苗论文参考文献
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[6].李双斌.以伪狂犬病毒为载体的二价基因工程疫苗免疫效力评价[D].华中农业大学.2007
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[10].王新.猪2型圆环病毒、猪细小病毒核酸疫苗及猪2型圆环—猪细小—伪狂犬病叁价基因工程疫苗研究[D].四川农业大学.2006