新型初级纤毛标记和生物传感器转基因动物的建立与分析

论文摘要

纤毛是细胞表面突起的亚细胞区域,根据轴丝微管骨架结构9+2和9+0的差别可分为运动纤毛和初级纤毛（Primary Cilium,PC）[1]。PC因不含有中央微管轴丝,所以不具有运动功能。PC广泛存在于脊椎动物细胞中,研究显示每个细胞有且仅有一根PC[2]。研究证明PC参与多个细胞信号转导途径的调控,如Hedgehog（Hh）、PDGF和WNT信号通路的调控[3]。Hh信号通路是一个在脊椎动物中高度保守的信号转导通路,在动物早期胚胎发育、形态建成以及个体物质能量代谢稳态维持中发挥着重要作用[4]。然而目前对PC在调节Hh通路信号转导的分子机制并不明确。我们前期研究认为PC中的PKA活性可能是调控Hh信号传导的关键,对该假设的验证需要能够在细胞层面监控PC中PKA活性以及其它细胞内可能参与信号传导的分子,如Ca2+等。然而目前对PC区域内信号分子检测缺乏有效的研究方法和研究材料,使得无法精细解析PC在调控Hh信号通路作用以及与PC相关其他信号通路的分子机制。为了解决上述研究的瓶颈,本论文以斑马鱼作为模式动物,旨在建立可以稳定标记PC,以及可以用于检测PC内各种信号分子的生物传感器的生物材料。通过文献检索和实验验证,本研究使用斑马鱼肾消耗相关蛋白3（Nephosistin3,Nphp3）的N末端作为PC定位信号肽,构建zNphp3N-mCherry融合蛋白标记PC,zNphp3N-AKAR2和zNphp3N-GCaMP6分别用于检测PC中的PKA活性和Ca2+。以上融合基因应用ubiquitin和β-actin广泛表达启动子启动,使得所有细胞均可表达上述融合蛋白。本研究成功筛选获得了4种稳定斑马鱼转基因材料,分别为:Tg（β-actin-zNphp3N-mCherry）,Tg（β-actin-zNphp3N-AKAR2）,Tg（Ubi-zNphp3N-AKAR2）,Tg（β-actin-zNphp3N-GCaMP6）。这些稳定转基因品系的胚胎发育正常,没有出现明显的畸形,成体表现正常,稳定可育。进一步通过FRET实验验证zNphp3N-AKAR2对于PC中PKA活性的检测功能,在抑制细胞整体PKA活性dnPKA处理后,未检测到FRET效率,反之在PKA激活剂Foskolin处理组,检测到较强的FRET效率,显示转基因胚胎中zNphp3N-AKAR2可以很好的指示PKA的活性。进而在Hh通路抑制剂Cyclopamine处理组中,可以检测到较高的FRET效率,初步证明PC中的PKA活性确实与Hh通路活性直接相关。分子机制的研究最终拟用于回答人类Hh通路疾病的致病机理。我们临床发现一个新的Hh通路异常激活的家系。经过一系列临床指标的检测,可以证实该家系为Gorlin综合症的家系。进行了全外显子测序分析其致病机制,我们发现PTCH1的一个新的INDEL突变,导致PTCH1提前终止,因此导致Hh信号通路活性上调。进而我们拟应用转基因材料检测PTCH1的截短蛋白是否可以导致PC中PKA活性的变化,以期详细阐明Gorlin综合症的致病机理。综上所述,我们构建了可以用于精细研究PC功能和信号分子变化的转基因材料,并建立的相应的检测方法,为Hh通路分子机制的研究和PC相关的分子机制的研究提供了重要的方法和材料。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
•   1.1 纤毛
•     1.1.1 纤毛的结构和功能
•   1.2 初级纤毛（Primary Cilium）
•   1.3 Hedgehog信号通路
•   1.4 初级纤毛和Hedgehog信号通路的关系以及Hh通路研究的难点
•   1.5 FRET检测PKA活性的研究情况
•   1.6 斑马鱼模式动物
•   1.7 本研究的内容和意义
• 第二章 zNPHP3 N端肽段作为初级纤毛定位信号肽的功能验证
•   引言
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 实验仪器
•     2.1.4 实验方法
•       2.1.4.1目的基因克隆实验
•       2.1.4.2胶回收实验
•       2.1.4.3 Gibson Assembly连接反应
•       2.1.4.4 测序结果分析与质粒提取
•       2.1.4.5 体外转录
•       2.1.4.6 显微注射
•       2.1.4.7 胚胎免疫荧光染色
•   2.2 实验结果
•     2.2.1 斑马鱼zNphp3 基因的生物信息学分析
•     2.2.2 斑马鱼全长蛋白z Nphp3 和截短多肽zNphp3N的亚细胞定位情况
•       2.2.2.1 斑马鱼zNphp3 全长蛋白可以定位初级纤毛
•       2.2.2.2 斑马鱼zNphp3N截短多肽可以定位初级纤毛
•   2.3 讨论
• 第三章 稳定转基因品系的构建及品系鉴定
•   引言
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验材料
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器
•     3.1.4 引物设计
•     3.1.5 实验方法
•       3.1.5.1 载体构建
•       3.1.5.2 遗传筛选
•       3.1.5.3 胚胎免疫荧光染色
•       3.1.5.4 原位杂交
•   3.2 实验结果
•     3.2.1 获得稳定斑马鱼转基因品系
•     3.2.3 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛的标记情况
•       3.2.3.1 稳定斑马鱼转基因品系初级纤毛成功标记mCherry和 AKAR
•     3.2.4 原位杂交实验结果
•       3.2.4.1 原位杂交探针ptch2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息
•       3.2.4.2 原位杂交探针olig2在AB型与转基因斑马鱼中的表达信息
•   3.3 讨论
• 第四章 AKAR2 的功能验证
•   引言
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 主要试剂
•     4.1.2 主要仪器
•     4.1.3 实验方法
•   4.2 实验结果
•     4.2.1 PKA生物传感器建立成功
•     4.2.2 PKA在 Hh信号通路中的功能分析
•   4.3 讨论
• 第五章 Hh通路异常疾病Gorlin综合症致病机制的研究
•   引言
•   5.1 研究对象与实验方法
•     5.1.1 研究对象
•     5.1.2 实验方法
•       5.1.2.1 临床病例分析
•       5.1.2.2 血液基因组DNA的提取
•       5.1.2.3 全外显子测序
•       5.1.2.4 Sanger测序验证突变位点
•   5.2 实验结果
•     5.2.1 临床病理特征分析
•     5.2.2 先证者的家系图
•     5.2.3 家系成员PTCH1 突变的鉴定
•   5.3 讨论
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄卓雅

导师: 赵仲华

关键词: 初级纤毛,转基因斑马鱼,信号通路,荧光能量共振转移技术

来源: 山西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 山西大学

分类号: Q78;R346

DOI: 10.27284/d.cnki.gsxiu.2019.000292

总页数: 70

文件大小: 4721K

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