霉菌实时荧光核酸恒温扩增检测技术研究

论文摘要

以霉菌几丁质合酶Ⅲ保守序列作为靶序列设计引物,合成分子信标探针;以黑曲霉菌ATCC（16404）DNA为模板,通过PCR、分子克隆、转录构建靶标RNA,进而建立实时荧光核酸恒温扩增技术（simultaneous amplification and testing,SAT）,并对体系内相应成分进行优化;最后利用优化的SAT体系检测食品污染中常见的病原微生物,评价SAT方法的特异性;针对不同浓度的黑曲霉菌孢子悬液,提取RNA进行SAT检测,评价SAT方法的灵敏性。结果表明,SAT检测体系中引物浓度为10μmol·L-1及探针浓度为10μmol·L-1时,反应曲线最佳;扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与培养的黑曲霉菌孢子量的对数存在线性相关关系（y=-7.061x+59.567,R2=0.961 1）,该方法的灵敏度为103个·mL-1孢子,用该方法检测食品中常见污染菌,发现仅黑曲霉菌出现荧光信号。初步建立了黑曲霉菌的SAT检测体系,可与食品常见污染细菌相鉴别,特异性达100%,进一步提高灵敏度后,可成为食品中黑曲霉菌检测的新方法。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料与试剂
•   1.2 试验方法
•     1.2.1 SAT引物及分子信标探针序列设计
•     1.2.2 靶标RNA的获得
•       1.2.2.1 目的DNA的获得
•       1.2.2.2 重组质粒“pGM-T-目的DNA”构建与鉴定
•       1.2.2.3 目的DNA的转录
•     1.2.3 SAT检测体系的建立及优化
•       1.2.3.1 引物浓度的优化
•       1.2.3.2 探针浓度的优化
•     1.2.4 SAT检测体系的评价
•       1.2.4.1 特异性分析
•       1.2.4.2 灵敏度分析
•       1.2.4.3 SAT反应体系可行性分析
• 2 结果与分析
•   2.1 靶标RNA的获得
•     2.1.1 黑曲霉菌目的DNA片段的获得
•     2.1.2 重组质粒“pGM-T-目的DNA”的构建及鉴定
•     2.1.3 目的DNA的转录
•   2.2 SAT检测体系的建立及优化
•   2.3 黑曲霉菌SAT检测体系的评价
•     2.3.1 特异性分析
•     2.3.2 灵敏度分析
•     2.3.3 体系灵敏度检测可行性分析
• 3 结论与讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 孙皖如,马玉帅,许向华,乌日琴,张玉妥

关键词: 实时荧光恒温检测技术,黑曲霉菌,核糖核酸

来源: 河南农业大学学报 2019年05期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 河北北方学院,上海仁度生物科技有限公司

基金: 张家口市重大科技成果转化项目(1811002A)

分类号: Q78;TS207.4

DOI: 10.16445/j.cnki.1000-2340.2019.05.014

页码: 769-776

总页数: 8

文件大小: 2359K

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