极端微生物耐辐射奇球菌合成功能性纳米金颗粒的机制及其特性研究

论文摘要

纳米金颗粒（gold nanoparticles,AuNPs）是金的任一维度介于 1 nm 至100 nm之间的微细颗粒,具有独特的理化性质,在生物传感、纳米医学等领域应用广泛。微生物合成纳米金的方法具有经济、安全、环保等优势,备受研究人员的关注。然而,其合成机制和功能尚缺乏深入的研究;而且,在极端环境下大部分微生物不能很好地存活及合成纳米金。极端微生物-耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans,简称Dr）胞内抗逆成分资源丰富,对辐射、高氧化等极端环境具有显著抗性。因此,研究耐辐射奇球菌在高效合成纳米材料中的作用机制及功能特性具有重要意义。本研究采用生物化学、纳米材料学、分子生物学、细胞生物学、转录组学等方法,研究了耐辐射奇球菌吸附还原Au（Ⅲ）离子并生物合成功能性纳米金颗粒的能力、过程及形成的纳米材料的功能特性,揭示了耐辐射奇球菌生物合成功能性纳米金颗粒的分子机制及颗粒功能的作用机理。主要结果如下:1.发现耐辐射奇球菌具有较强的Au（Ⅲ）离子耐受能力,胞内外均可高效还原Au（Ⅲ）并合成纳米金颗粒（Dr-AuNPs）;而且,菌体细胞合成AuNPs的速率也相对高于大肠杆菌等细菌。合成的Dr-AuNPs主要呈球形,Zeta电位为-20.01+0.17 mV,其分布在菌体的胞内、胞质及胞外。研究表明,Au（Ⅲ）是通过与菌体生物分子上的羧基、羟基、胺和含磷基团的结合,先后被还原至Au（Ⅰ）及Au（0）,进而在上述基团的包被作用下形成稳定的Dr-AuNPs。Dr-AuNPs能够通过损伤金黄色葡萄球菌等细菌的外被而表现出抑菌活性,但对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、正常大鼠肾细胞NRK均无明显毒性;Dr-AuNPs可以用作抑菌剂。2.鉴定了包被在Dr-AuNPs表面的蛋白质,发现菌体蛋白质参与形成功能性AuNPs。利用菌体蛋白质介导合成的纳米金（Drp-AuNPs）呈球形,粒径为51.72±7.38nm,其表现出较好的稳定性。Au（Ⅲ）与菌体蛋白质的羟基、羧基、胺、巯基和含磷基团发生相互作用后,其被还原至Au（Ⅰ）及Au（0）,Au（0）再被进一步包被形成稳定的Drp-AuNPs。研究发现,菌体细胞抗氧化体系中的蛋白质CrtI和Dps2表现出不同的合成AuNPs的能力,这可能与蛋白质的氨基酸组成及其本身的还原能力相关。与常用的柠檬酸钠-纳米金（SC-AuNPs）相比,Drp-AuNPs表面有蛋白质的包被,因而颗粒稳定性较好、无明显细胞毒性,在生物传感、药物载体等领域具有一定的应用潜力。3.发现耐辐射奇球菌胞内的特种四萜类化合物-耐辐射奇球菌素（Deinoxanthin,DX）能够高效合成由DX氧化产物功能化的DX-AuNPs,并阐明了其合成机制。DX是通过其环和碳链上羟基的脱氢作用提供电子,迅速还原Au（Ⅲ）至Au（Ⅰ）,然后进一步还原Au（Ⅰ）至Au（0）并在DX3（去质子化的2-ketodeinoxanthin）的包被作用下形成稳定的DX-AuNPs。合成的DX-AuNPs呈球形,电动电势为-24.95±0.38mV。与SC-AuNPs相比,DX-AuNPs对乳腺癌细胞MCF-7及肾癌细胞ACHN有更为显著的抑制作用,但对正常细胞NRK并未表现出明显的毒性。DX-AuNPs能够积累在MCF-7的细胞质、细胞器和细胞核中,在细胞内诱导自噬、活性氧产生、DNA损伤等作用,进而导致肿瘤细胞凋亡。转录组测序表明,DX-AuNPs显著影响（上调或下调）MCF-7细胞的基因表达水平,DX-AuNPs的诱导肿瘤细胞凋亡功能可能主要归因于DX-AuNPs对细胞内生长代谢、氧化应激、自噬、细胞凋亡等相关基因表达的影响。本研究表明,极端微生物-耐辐射奇球菌菌体细胞、蛋白质、特种代谢产物（四萜）等都可以还原转化Au（Ⅲ）离子,形成具有不同活性基团包被的功能性纳米金。研究结果揭示了耐辐射奇球菌中参与AuNPs合成的生物活性分子及其功能基团,阐释了耐辐射奇球菌生物合成功能化AuNPs的机制及其功能特性,为生物合成功能性纳米材料提供了基础和原料,同时为深入阐述生物合成金属纳米材料的机制和功能化修饰纳米材料提供了新的借鉴和参考。此外,研究结果也将为耐辐射奇球菌合成的功能性AuNPs等纳米材料在生物、医学等领域的应用提供支持。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 主要缩略词
• 1 文献综述
•   1.1 纳米金的基本性质
•     1.1.1 生物惰性
•     1.1.2 细胞毒性
•     1.1.3 表面等离子体共振效应
•     1.1.4 超分子与分子识别特性
•     1.1.5 荧光特性
•     1.1.6 催化特性
•     1.1.7 电化学特性
•     1.1.8 其他特性
•   1.2 AuNPs的应用
•     1.2.1 抑菌作用
•     1.2.2 生物传感
•     1.2.3 病原生物检测
•     1.2.4 药物运输
•     1.2.5 基因传递
•     1.2.6 癌症诊疗
•     1.2.7 酶的固定化
•     1.2.8 免疫分析
•     1.2.9 其它应用
•   1.3 AuNPs的合成
•     1.3.1 物理合成
•     1.3.2 化学合成
•     1.3.3 生物合成
•       1.3.3.1 植物合成
•       1.3.3.2 微生物合成
•       1.3.3.3 AuNPs的生物合成机制
•   1.4 耐辐射奇球菌简介
•     1.4.1 耐辐射奇球菌的抗性及DNA损伤修复能力
•     1.4.2 抗氧化系统
•       1.4.2.1 酶类自由基清除剂
•       1.4.2.2 非酶类抗氧化剂
•     1.4.3 耐辐射奇球菌的金属还原及生物修复能力
• 2 耐辐射奇球菌生物合成纳米金颗粒及其抑菌特性研究
•   2.1 引言
•   2.2 材料与方法
•     2.2.1 主要菌种和试验材料
•     2.2.2 主要仪器
•     2.2.3 耐辐射奇球菌菌体对Au（Ⅲ）的耐受性分析
•     2.2.4 耐辐射奇球菌菌体对溶液中Au（Ⅲ）的吸附作用分析
•     2.2.5 Dr-AuNPs的制备
•     2.2.6 Dr-AuNPs的特性表征
•     2.2.7 Dr-AuNPs合成过程分析
•     2.2.8 Dr-AuNPs的抑菌试验
•     2.2.9 Dr-AuNPs的细胞毒性分析
•   2.3 结果与分析
•     2.3.1 耐辐射奇球菌对Au（Ⅲ）的耐受及吸附作用
•     2.3.2 耐辐射奇球菌介导AuNPs的合成
•     2.3.3 反应条件对生物合成Dr-AuNPs的影响
•     2.3.4 Dr-AuNPs的特性表征
•     2.3.5 Dr-AuNPs的合成机制
•     2.3.6 Dr-AuNPs的抑菌活性
•     2.3.7 Dr-AuNPs的细胞毒性分析
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 3 耐辐射奇球菌蛋白质合成纳米金颗粒的机制及其特性
•   3.1 引言
•   3.2 材料与方法
•     3.2.1 试验材料与试剂
•     3.2.2 主要试验仪器
•     3.2.3 Dr-AuNPs表面包被的蛋白质鉴定方法
•     3.2.4 菌体蛋白质提取物的制备
•     3.2.5 Drp-AuNPs的合成
•     3.2.6 Drp-AuNPs的特性表征
•     3.2.7 单一蛋白合成AuNPs的能力比较
•     3.2.8 Drp-AuNPs的释放动力学分析
•     3.2.9 细胞毒性检测
•     3.2.10 细胞内ROS检测
•   3.3 结果与分析
•     3.3.1 Drp-AuNPs的合成
•     3.3.2 Drp-AuNPs的表征
•     3.3.3 Drp-AuNPs的合成机制
•     3.3.4 单一蛋白质合成AuNPs的能力
•     3.3.5 Drp-AuNPs细胞毒性的检测与分析
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 4 耐辐射奇球菌素合成纳米金颗粒的机制及其抑制肿瘤细胞的作用机理
•   4.1 引言
•   4.2 材料与方法
•     4.2.1 试验材料与试剂
•     4.2.2 主要试验仪器
•     4.2.3 耐辐射奇球菌素（DX）的提取纯化
•     4.2.4 DX-AuNPs的合成
•     4.2.5 DX-AuNPs的特性表征
•     4.2.6 DX-AuNPs的合成过程表征
•     4.2.7 DX-AuNPs对细胞生长的影响
•       4.2.7.1 细胞培养与收集
•       4.2.7.2 AuNPs的细胞毒性检测
•     4.2.8 DX-AuNPs对肿瘤细胞的抑制机理分析
•       4.2.8.1 细胞生物学分析
•       4.2.8.2 基因表达变化分析
•   4.3 结果与分析
•     4.3.1 DX的提取纯化
•     4.3.2 DX-AuNPs的合成
•     4.3.3 DX-AuNPs的表征
•     4.3.4 DX-AuNPs的合成机制
•       4.3.4.1 DX-AuNPs的FTIR分析
•       4.3.4.2 DX-AuNPs的NMR分析
•       4.3.4.3 DX-AuNPs的XPS分析
•       4.3.4.4 DX-AuNPs的LC-MS分析
•     4.3.5 DX-AuNPs对肿瘤细胞的抑制作用
•       4.3.5.1 DX-AuNPs对细胞存活率的影响
•       4.3.5.2 DX-AuNPs对肿瘤细胞MCF-7的生理影响
•       4.3.5.3 DX-AuNPs对肿瘤细胞MCF-7基因表达水平的影响
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 5 总结与展望
•   5.1 总结
•   5.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 博士期间发表的论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 李九龙

导师: 田兵

关键词: 耐辐射奇球菌,纳米金颗粒,生物合成,功能性,肿瘤细胞抑制作用

来源: 浙江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,材料科学

单位: 浙江大学

基金: 国家自然科学基金(项目编号:31870025,31670083,31570058,31370119和31210103904)

分类号: TB383.1;Q93

总页数: 161

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