绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究

论文摘要

脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UCMSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞。UCMSCs具有来源丰富、不涉及伦理道德、低免疫原性、体外扩增能力强及能分化为多种体细胞等特征,因此,UCMSCs的相关研究备受关注。目前,已成功从人、大鼠、兔、猪等动物分离获得脐带间充质干细胞,但与其相比,关于绵羊脐带间充质干细胞（sheep Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,sUCMSCs）的分离、培养及定向分化等研究的相关报道甚少。绵羊是基础生物学及畜牧学等研究领域的重要大动物模型。据此,本研究在改良sUCMSCs分离及培养体系的基础上,探讨了诱导sUCMSCs为诱导多能性干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs）的同时将sUCMSCs定向诱导分化为成肌细胞并初步探究其在体内修复损伤组织的作用机制。本研究主要研究结果如下:1.建立了组织块二次贴壁分离绵羊脐带间充质干细胞的方法,并用改良的无血清体系在体外扩增培养获得了绵羊脐带间充质干细胞,经鉴定,所获得的sUCMSCs的免疫表型在高表达CD90、CD105及CD44（表达量在95%以上）的同时,低表达CD45、CD34及CD14（表达量在2%以下）。此外,组织块二次贴壁法获得的sUCMSCs可在体外传至12代,并且能向成骨、成脂及成软骨细胞方向分化。2.采用Yamanaka的OSKM四因子方法诱导sUCMSCs为iPSCs,获得了类胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）的克隆样细胞,对其进行碱性磷酸酶染色鉴定,结果显示克隆呈棕红色的阳性结果;此外,对所获得的克隆进行多能性因子表达情况的检测,结果发现,克隆表达多能性因子OCT-4、SSEA-4、Nanog及TRA-1-81;为检测获得的sUCMSCs来源的克隆在体内分化能力,将克隆制备成单细胞悬液后注射免疫缺陷小鼠腋下,在注射后第4周采集畸胎瘤制成石蜡切片后进行HE染色,在倒置显微镜下可观察到肌肉、毛囊、腺体等三个胚层的组织。3.采用5-氮杂胞苷联合马血清法,诱导sUCMSCs分化为成肌细胞,检测分化不同时期成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD与标志分子Desmin、Myf5及MyoG的表达情况;此外,将sUCMSCs、分化第14天的成肌细胞及丝裂霉素C处理的sUCMSCs移植入肌肉损伤模型小鼠的胫骨前肌,在移植细胞后不同时间经石蜡切片并HE染色,检测小鼠损伤的肌肉的修复情况。结果显示:（1）在5-氮杂胞苷及马血清的联合作用下,sUCMSCs在诱导分化第3天Myf5基因开始表达;第7天个别细胞形态发生改变,呈杆状、多角状,细胞增殖减缓,且成肌细胞标志蛋白Desmin、MyHC及MyoD均有表达,有部分细胞发生融合;在分化第14天Desmin及MyoG基因表达量升高,细胞增殖持续减缓,融合细胞增多,且融合后的细胞内细胞核增多;在分化的第21天Desmin基因表达量骤升,且细胞代谢产物增多,出现肌管样结构;（2）在细胞移植后,sUCMSCs组小鼠损伤肌肉后第2天即进入修复期,在第10天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;成肌细胞组小鼠损伤肌肉第3天即进入修复期,在第14天肌纤维排列致密,彼此融合,损伤肌肉基本恢复正常;丝裂霉素C组及对照组小鼠损伤肌肉在第2-3天进入修复期,且在第10天损伤肌肉未能完全修复,肌纤维之间仍存在明显的空隙,第14天肌肉也未能完全恢复正常。综上所述,采用二次贴壁法及无血清培养体系可获得形态及体外增殖能力正常、且表达间充质干细胞表面标志分子并具有多向分化潜能的sUCMSCs。所获得的sUCMSCs不仅能诱导为iPSCs,而且可分化为对小鼠损伤肌肉有修复功能的成肌细胞。本研究为建立完善的绵羊诱导多能干细胞技术及探明间充质干细胞的定向分化及修复机制提供科学依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 脐带间充质干细胞
•     1.1.1 脐带间充质干细胞的来源
•     1.1.2 脐带间充质干细胞的的分离培养
•     1.1.3 脐带间充质干细胞的形态特征和生长特性
•     1.1.4 脐带间充质干细胞的的鉴定标准
•   1.2 脐带间充质干细胞的主要生物学特性
•     1.2.1 脐带间充质干细胞的分化潜能
•     1.2.2 诱导多能干细胞系的建立与发展
•     1.2.3 脐带间充质干细胞的的免疫调节特性
•   1.3 脐带间充质干细胞的应用
•     1.3.1 脐带间充质干细胞的应用
•     1.3.2 脐带间充质干细胞的作用机制
•     1.3.3 脐带间充质干细胞应用的局限性
•     1.3.4 脐带间充质干细胞应用的展望
•   1.4 绵羊脐带间充质干细胞的研究进展
•   1.5 诱导多能性干细胞研究进展
•     1.5.1 制备诱导多能干细胞的方法
•     1.5.2 绵羊诱导多能性干细胞
•   1.6 研究目的及意义
• 2 绵羊脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定
•   2.1 材料与试剂
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 主要仪器
•     2.1.3 主要试剂及配制方法
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 绵羊脐带间充质干细胞原代分离及培养
•     2.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的传代培养
•     2.2.3 绵羊脐带间充质干细胞实验分组
•     2.2.4 绵羊脐带间充质干细胞表面标志物的检测
•     2.2.5 绵羊脐带间充质干细胞增殖曲线的检测
•     2.2.6 绵羊脐带间充质干细胞体外分化的检测
•     2.2.7 数据统计学分析
•   2.3 结果
•     2.3.1 绵羊脐带间充质干细胞的的原代培养
•     2.3.2 绵羊脐带间充质干细胞的的传代培养
•     2.3.3 绵羊脐带间充质干细胞的增殖能力
•     2.3.4 绵羊脐带间充质干细胞的表面标志物
•     2.3.5 绵羊脐带间充质干细胞的分化能力
•   2.4 讨论
•   2.5 本章小结
• 3 绵羊脐带间充质干细胞诱导多能性干细胞
•   3.1 材料与试剂
•     3.1.1 实验动物
•     3.1.2 实验质粒
•     3.1.3 主要仪器
•     3.1.4 主要试剂及配制方法
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 多能性诱导因子无内毒素质粒的制备
•     3.2.2 实验细胞的准备及培养
•     3.2.3 逆转录病毒的制备
•     3.2.4 逆转录病毒的侵染
•     3.2.5 绵羊诱导多能干细胞的传代培养、冻存及复苏
•     3.2.6 绵羊诱导多能干细胞的鉴定
•   3.3 结果
•     3.3.1 逆转录病毒的包装和侵染
•     3.3.2 绵羊诱导多能干细胞过程中细胞形态变化
•     3.3.3 绵羊诱导多能干细胞克隆的鉴定
•   3.4 讨论
•   3.5 本章小结
• 4 绵羊脐带间充质干细胞的定向分化
•   4.1 材料与试剂
•     4.1.1 实验动物
•     4.1.2 主要仪器
•     4.1.3 主要试剂及配制方法
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 丝裂霉素C处理绵羊脐带间充质干细胞
•     4.2.2 绵羊脐带间充质干细胞的成骨分化
•     4.2.3 绵羊脐带间充质干细胞的成脂分化
•     4.2.4 绵羊脐带间充质干细胞的成软骨分化
•     4.2.5 慢病毒包装及侵染
•     4.2.6 绵羊脐带间充质干细胞诱导分化成肌细胞
•     4.2.7 免疫荧光检测成肌细胞标志物
•     4.2.8 提取细胞总RNA
•     4.2.9 RNA反转录为cDNA
•     4.2.10 实时定量PCR检测成肌细胞标志基因表达
•     4.2.11 制备胫骨前肌损伤小鼠模型
•     4.2.12 细胞移植肌肉损伤小鼠
•     4.2.13 石蜡切片—组织块包埋
•     4.2.14 石蜡切片—切片
•     4.2.15 石蜡切片—HE染色
•     4.2.16 Western Blot检测移植细胞来源
•   4.3 结果
•     4.3.1 绵羊脐带间充质干细胞成肌细胞分化形态变化
•     4.3.2 成肌细胞的检测
•     4.3.3 小鼠肌肉损伤修复
•   4.4 讨论
•   4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 附件

文章来源

类型: 博士论文

作者: 杜文敬

导师: 安铁洙

关键词: 绵羊,定向分化,诱导多能干细胞,脐带间充质干细胞

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东北林业大学

分类号: Q813

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000077

总页数: 97

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