猪肺炎支原体硫辛酸蛋白连接酶的克隆、多克隆抗体制备及其酶学功能的鉴定

论文摘要

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是引起猪支气管肺炎的主要病原,Mhp感染死亡率不高,但感染后定殖到呼吸道纤毛组织,破坏纤毛屏障,易引起多种疾病混合感染,给养猪业带来极大危害。Mhp结构简单,但培养环境相对较为苛刻,难以分离培养,对其深入研究带来极大困难。开展有关猪肺炎支原体代谢的相关研究有助于我们更好的了解其生长机制。硫辛酸（Lipoic acid,LA）是高效抗氧化剂,广泛存在于动物、植物及微生物中,在有机体的能量代谢过程中起着重要作用。LA是生物体能量代谢过程中多种多酶复合物的辅酶,包括α-酮戊二酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶以及甘氨酸裂解系统,这些多酶复合物在生物体能量代谢、脂肪酸合成以及氨基酸降解中发挥重要作用。生物体中LA的代谢主要是在相关酶的的催化作用下,以共价键方式连接到一类含有硫辛酸结合结构域（Lipol Domain,LD）的蛋白分子上,该过程又称为硫辛酸修饰。硫辛酸修饰对于微生物的生长代谢至关重要,但仅少数微生物的硫辛酸修饰途径研究较为透彻,对一些物种的研究发现其硫辛酸蛋白连接酶在生物体硫辛酸代谢中发挥重要作用。目前关于猪肺炎支原体硫辛酸蛋白连接酶（Lipoate Protein Ligase,Lpl）的研究还没有相关文献报道。为了分析Mhp中是否存在天然的Lpl,本研究制备了抗Mhp rLpl的多克隆抗体。用制备的多克隆抗体在蛋白质水平检测到Mhp中存在天然的Lpl。然后通过体外反应进行Lpl的功能研究,Western blot实验结果显示Mhp Lpl能够将硫辛酸分子转移至Mhp GcvH上的LD上。进一步对Mhp Lpl的结构功能探究,结合rLpl蛋白晶体结构解析对Mhp Lpl的大小域分别进行克隆表达,并通过体外实验确定其大域能够完成硫辛酸转移过程,小域在硫辛酸催化反应中不能完成硫辛酸转移。为进一步探究Lpl转移硫辛酸至Mhp GcvH上的硫辛酸结合位点,本研究利用定点突变技术对其GcvH上的赖氨酸进行单点突变,将突变成功的重组质粒表达纯化后分别进行体外实验,结果显示第56位赖氨酸为硫辛酸结合位点。综上,本研究首次发现了Mhp上存在Lpl,确定了Mhp Lpl能够完成LA代谢反应,证明了Mhp Lpl大域和小域的功能,同时还发现了Mhp Lpl转移硫辛酸至GcvH的第56位赖氨酸。本研究有助于我们更好的理解Mhp的生长特性及代谢机制,为Mhp硫辛酸代谢相关酶的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
•   1.1 猪肺炎支原体
•     1.1.1 猪肺炎支原体概述
•     1.1.2 Mhp病原学特征
•     1.1.3 Mhp病理学特征
•     1.1.4 Mhp的流行病学特征
•     1.1.5 Mhp的诊断
•     1.1.6 Mhp的防控
•     1.1.7 Mhp的研究进展
•   1.2 硫辛酸
•     1.2.1 硫辛酸概述
•     1.2.2 硫辛酸代谢机制
•   1.3 硫辛酸蛋白连接酶研究进展
•   1.4 研究目的与意义
• 第二章 猪肺炎支原体硫辛酸蛋白连接酶多克隆抗体的制备
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 菌株、质粒、细胞、实验动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器及其设备
•     2.1.4 主要溶液及其配制
•   2.2 实验方法
•     2.2.1 Mhp lpl基因的分析
•     2.2.2 Mhp基因组的提取
•     2.2.3 Mhp lpl基因的克隆
•     2.2.4 重组质粒pET-32a-lpl的构建
•     2.2.5 Mhp硫辛酸蛋白连接酶的表达工艺优化
•     2.2.6 Mhp Lpl多克隆抗体的制备
•     2.2.7 Mhp Lpl鉴定
•   2.3 结果
•     2.3.1 Mhp lpl基因分析
•     2.3.2 Mhp lpl基因的克隆与鉴定
•     2.3.3 Mhp硫辛酸蛋白连接酶的表达工艺优化
•     2.3.4 Mhp rLpl多克隆抗体的制备
•     2.3.5 Mhp硫辛酸蛋白连接酶的鉴定
•   2.4 小结
•   2.5 讨论
• 第三章 猪肺炎支原体硫辛酸蛋白连接酶的活性分析
•   3.1 实验材料
•     3.1.1 菌株和质粒
•     3.1.2 主要试剂
•     3.1.3 主要仪器设备
•     3.1.4 主要溶液及其配制
•   3.2 实验方法
•     3.2.1 大肠杆菌LplA硫辛酸催化反应的重建
•     3.2.2 Mhp GcvH表达纯化
•     3.2.3 Mhp Lpl活性分析
•     3.2.4 Mhp Lpl的结构域功能分析
•   3.3 结果
•     3.3.1 大肠杆菌LplA硫辛酸催化反应的重建
•     3.3.2 Mhp GcvH的表达纯化
•     3.3.3 Mhp Lpl活性分析
•     3.3.4 Mhp Lpl的结构域功能分析
•   3.4 小结
•   3.5 讨论
• 第四章 Mhp硫辛酸蛋白连接酶底物H蛋白上活化位点探究
•   4.1 实验材料
•     4.1.1 菌株和质粒
•     4.1.2 主要试剂
•     4.1.3 主要仪器设备
•   4.2 实验方法
•     4.2.1 Mhp GcvH赖氨酸单点突变
•     4.2.2 Mhp GcvH硫辛酸结合位点探究
•   4.3 结果
•     4.3.1 Mhp GcvH赖氨酸突变质粒构建及表达纯化
•     4.3.2 Mhp GcvH硫辛酸结合位点探究
•   4.4 小结
•   4.5 讨论
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱可蒙

导师: 刘恒贵

关键词: 猪肺炎支原体,硫辛酸蛋白连接酶,硫辛酸

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

分类号: S852.62

总页数: 57

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