人Smurf1基因真核表达质粒的构建和表达

论文摘要

[目的]构建人Smurf1基因的真核表达载体并检测其表达和细胞亚定位。[方法]PCR法从人胚肾细胞HEK-293T中扩增Smurf1基因的ORF序列,将其插入到带Flag标签的p CMV5真核表达载体,插入位点为限制性内切酶SalⅠ和XbaⅠ之间。酶切并测序鉴定该质粒的正确性。将成功构建的质粒Flag-Smurf1转染HEK-293T细胞和Hela细胞,Western Blotting检测Smurf1蛋白的表达情况;转染Mv. 1. Lu细胞,免疫荧光检测Smurf1蛋白在细胞中的亚定位。[结果]成功扩增出Smurf1基因的ORF序列;连入p CMV5中获得了质粒Flag-Smurf1;酶切鉴定得到2. 2 kb大小的片段,测序结果显示连入的是Smurf1基因的c DNA序列正确。Western Blotting结果显示该质粒可在HEK-293T细胞和Hela细胞中表达,表达大小约为80 k Da,符合预期。免疫荧光实验结果显示过表达的Smurf1主要定位在细胞膜上。[结论]成功构建了带Flag标签的人Smurf1基因的真核表达质粒,该质粒可在细胞中顺利表达。

论文目录

• 1 材料与方法
•   1.1 材料
•     1.1.1 实验材料
•     1.1.2 试剂
•     1.1.3 仪器
•     1.1.4 培养基
•   1.2 方法
•     1.2.1 人HEK-293T细胞总RNA的提取和cDNA第一链的合成
•     1.2.2 获得Smurf1基因片段
•     1.2.3 真核表达重组质粒Flag-Smurf1的构建和双酶切鉴定
•     1.2.4 Flag-Smurf1表达产物的Western Blotting鉴定
•     1.2.5 Flag-Smurf1表达产物的免疫荧光分析
• 2 结果与分析
•   2.1 人HEK-293T细胞cDNA的合成
•   2.2 Smurf1基因的扩增
•   2.3 重组质粒Flag-Smurf1的构建和酶切鉴定
•   2.4 Western Blotting检测重组质粒Flag-Smurf1表达情况
•   2.5 免疫荧光检测重组质粒Flag-Smurf1表达情况
• 3 讨论
• 4 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李莎莎,贺虹,崔冠一,欧丽娜,邓博,王梅林

关键词: 分子克隆,转染,免疫荧光

来源: 生物技术 2019年03期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南科技大学医学院,解放军第988医院信息工程大学门诊部

基金: 国家自然科学基金项目(31500631)

分类号: Q782

DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2019.03.0036

页码: 205-209

总页数: 5

文件大小: 205K

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