利用准弹性中子散射研究蛋白质动力学随温度的演变

论文摘要

蛋白质被称为生命的发动机,承载着生命体内绝大多数的功能。地球上有成百上千万的蛋白质,它们的结构大不相同,行使着各式各样的生物功能。仅仅基于结构去理解和预测蛋白质的功能,往往会发现一些无法解释的现象,例如结构相似的蛋白质可能有着截然不同的功能,又或者结构差异很大的蛋白质从事类似的生物功能。这是因为蛋白质的动力学在决定蛋白质功能中也扮演着不可或缺的角色。对蛋白质动力学的研究,不仅可以加深对各种生命活动的理解,从而推动医药卫生的发展,还能够了解影响蛋白质稳定性和催化活性等特征的因素,进而促进生物技术的改进。然而,由于蛋白质自身的不稳定性和研究体系的复杂性,给蛋白质动力学研究带来了很大的困难。准弹性中子散射以其特有的能量和波长,对应着蛋白质动力学研究的时间（皮秒到纳秒）和空间（埃米到纳米）尺度。另外,中子散射具有对氢元素敏感和对样品无损伤的特点,使其成为蛋白质动力学研究中一种极为有效和独特的实验方法。本文利用准弹性中子散射研究蛋白质动力学随温度的演变,主要涉及两个重要的物理过程:低温（200K）的蛋白质动力学转变和高温（300K到363K）的蛋白质解折叠:1.不同结构的水合蛋白质都会在200 K发生一个动力学转变:低于此温度蛋白质主要展现简谐振动,高于此温度蛋白质就会柔化并展现出非简谐运动。在此温度以下,一些蛋白质不仅丢失其非简谐运动的自由度,同时也会失去生物活性。在过去三十年,很多实验和理论工作指出,蛋白质的动力学转变是由附着在蛋白质表面的水分子在200 K发生变化引起的,从而解释了不同蛋白质的动力学转变都在类似温度的原因。然而,当我们结合准弹性中子散射和全氘化蛋白技术时,发现即使不含水的冻干蛋白也会在200 K发生一个动力学转变。这个结果表明蛋白质的动力学转变这一现象的存在不依赖于水,是蛋白质固有的性质,但水的加入会大大增强这一转变现象。这一发现对过去三十年在此领域建立的经典图象——蛋白动力学转变是由水引起的,提出了挑战和质疑,将引导学术界对此课题的新的思考和研究。进一步结合不同时间分辨率的准弹性中子散射设备和介电谱实验方法,我们认识到冻干蛋白在200 K的动力学转变是由蛋白质主链运动随着温度降低而逐渐变慢,最终其相应特征弛豫时间超过了检测的时间尺度（100-1000s）,蛋白变得更刚性引起的。2.蛋白质大分子一般都不耐高温（50℃解折叠）,这限制了其在高效的酶工程及严苛的机理研究中的应用。因此,研究高温条件下蛋白质保持热稳定性的机理,进而提高蛋白的热稳定性成为了科学研究和工业生产所共同关注的问题。现有的酶工程设计往往致力于提高蛋白质的分子间作用力,即从焓的角度提升蛋白质的热稳定性。当我们使用准弹性中子散射和核磁共振波谱对比研究细胞色素P450家族的常温蛋白质CYP101A1和嗜热蛋白质CYP119时,我们发现CYP119比CYP101A1具有更高的结构柔性。这一反直觉的异常现象引起了我们的极大兴趣。因此我们利用荧光技术做出了两种蛋白质的热力学曲线,即吉布斯自由能相对于温度的函数。分析它们的热力学曲线发现,单从焓的角度出发,CYP119其实更不稳定,因为其焓的能垒更小。它之所以能耐高温是由于这个蛋白在解折叠过程中熵的增量非常小,即蛋白质解折叠的“内在动力”不足。通过深入分析动力学的实验数据,我们发现导致CYP119解折叠的熵变小的一个重要原因是其在自然折叠态的时候柔性非常高,换言之它在折叠态的熵已经很大,没有多大动力去解折叠。不同于常规的“高焓”机理,本研究发现折叠态柔性强这种“高熵”状态可以降低蛋白解折叠过程中熵的驱动力,从而使得蛋白质耐高温。另外,“高熵”状态还将有助于提高酶的生物活性,比如结合更多种类的底物,更高催化效率等。这一研究成果为将来设计新型耐热蛋白提供了全新的思路,即通过突变某些残基制备折叠态柔性高的蛋白质,使其同时具备耐热性和高活性的特征。综上所述,本文巧妙的利用准弹性中子散射的技术特点,系统的研究了低温（200K）的蛋白质动力学转变和高温（300K到363K）的蛋白质解折叠。本文对这两个物理过程的研究,既对蛋白质动力学在不同温度下的物理机制进行了深入探索,又展示了准弹性中子散射在蛋白质动力学研究中的巨大潜力,为准弹性中子散射在蛋白质动力学研究领域的应用打下了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
•   1.1 蛋白质动力学研究
•   1.2 准弹性中子散射在蛋白质动力学研究中的应用
•   1.3 准弹性中子散射在低温下蛋白质动力学转变研究中的应用
•   1.4 准弹性中子散射在高温下蛋白质热稳定性研究中的应用
•   1.5 本文的研究内容和创新
• 第二章 实验技术及其原理
•   2.1 准弹性中子散射
•     2.1.1 基本原理
•     2.1.2 样品制备
•     2.1.3 数据分析方法
•   2.2 介电谱
•     2.2.1 基本原理
•     2.2.2 样品制备
•     2.2.3 数据分析方法
•   2.3 核磁共振波谱
•     2.3.1 基本原理
•     2.3.2 样品制备
•     2.3.3 数据分析方法
•   2.4 分子动力学模拟
•     2.4.1 基本原理
•     2.4.2 模拟条件
•     2.4.3 数据分析方法
•   2.5 本章小结
• 第三章 利用准弹性中子散射研究低温下蛋白质动力学转变
•   3.1 研究背景
•   3.2 冻干条件下蛋白质的动力学转变
•   3.3 冻干条件下全氘化蛋白质的动力学转变
•   3.4 本章小结
• 第四章 利用准弹性中子散射研究蛋白质的高温解折叠
•   4.1 研究背景
•   4.2 蛋白质热稳定性比较
•   4.3 蛋白质结构柔性比较
•   4.4 蛋白质热力学分析
•   4.5 熵对蛋白质的影响
•   4.6 本章小结
• 第五章 总结和展望
•   5.1 主要结论
•   5.2 研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文及专利

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘卓

导师: 洪亮

关键词: 准弹性中子散射,蛋白质动力学,动力学转变,热稳定性,结构柔性

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 上海交通大学

分类号: Q51

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.000610

总页数: 153

文件大小: 10230K

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