桂花类胡萝卜素裂解关键基因CCD1的克隆及功能研究

论文摘要

类胡萝卜素及其衍生物不仅是许多抗逆物质生物合成的前体物,而且还调控植物花色、香气风味等,广泛应用于医药、卫生、食品、保健等行业。类胡萝卜素的裂解受类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenase,CCDs）调控。CCDs是植物体内类胡萝卜素裂解代谢途径中的关键酶,含有9个成员,其中CCD1的调控机制最为复杂。为了深入研究桂花OfCCD1基因在香气生物合成中的生理功能,本研究采用RACE-PCR技术克隆桂花的OfCCD1基因,并进行核酸序列、蛋白质序列的分析,了解其结构特点;利用半定量PCR方法研究OfCCD1基因表达模式与含量变化,明确其表达规律;采用原核表达的方法进行诱导、纯化CCD1蛋白质,鉴定其氧化酶活性;利用叶盘法转化法和花序浸染法转化烟草和拟南芥,揭示其生理功能,取得如下实验结果:1、核酸序列分析结果表明,桂花OfCCD1基因的完整开放读码框（ORF）长度为1632 bp,编码的蛋白质序列含有543个氨基酸,分子式为C2785H4294N7200791S24,相对分子质量约为61288.52,理论等电点为6.27,脂溶指数80.77,总平均疏水指数为-0.262。其二级结构主要由α-螺旋（11.60%）、无规则卷曲（58.38%）、延伸链（23.76%）和β-转角（6.26%）组成,其蛋白质三维结构与玉米中的同源蛋白质VP14相似度最高;2、金桂、银桂、丹桂和四季桂OfCCD1基因均在香眼期时表达水平最低,依次在盛花初期、盛花中期、盛花中期和盛花初期时达到峰值,表明OfCCD1基因的表达丰度因桂花种类的不同而存在差异性表达,且具有时空特异性;3、0.5 M浓度的IPTG可以诱导OfCCD1蛋白的表达,通过镍柱纯化可以得到目的蛋白,分子量约为64KDa;同时利用His抗体进行鉴定,可以观察到目的条带,大小与目的蛋白相符合;4、采用叶盘法转化烟草植株,通过抗性筛选获得了抗性转基因植株,同时利用半定量PCR进行检测,可以扩增到OfCCD1基因;采用花序浸染法转化拟南芥植株（Col-0）,获得了 OfCCD1过表达的阳性植株,为进一步研究OfCCD1的生理功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
•   1.1 类胡萝卜素概述
•   1.2 类胡萝卜素的作用
•   1.3 类胡萝卜素的生物合成
•   1.4 类胡萝卜素氧化裂解的主要途径
•   1.5 类胡萝卜素裂解双加氧酶
•     1.5.1 CCD酶的特性
•     1.5.2 CCDs对植物香气和颜色的影响
•     1.5.3 OfCCD1基因对桂花香气和颜色的影响
•   1.6 本课题的研究目的与意义
• 2 桂花类胡萝卜素裂解关键基因OfCCD1的克隆与生物信息学分析
•   2.1 材料与方法
•     2.1.1 实验材料
•     2.1.2 实验试剂
•     2.1.3 总RNA提取及cDNA链合成
•     2.1.4 OfCCD1基因的克隆
•     2.1.5 OfCCD1序列分析
•   2.2 结果与分析
•     2.2.1 桂花总RNA的提取
•     2.2.2 OfCCD1基因的克隆
•     2.2.3 OfCCD1基因和蛋白序列的分析
•     2.2.4 蛋白质结构域分析
•     2.2.5 蛋白质二级结构分析
•     2.2.6 蛋白质三维结构模拟
•     2.2.7 OfCCD1基因的树状图分析
•   2.3 讨论与小结
• 3 桂花类胡萝卜素氧化裂解关键基因OfCCD1的表达分析
•   3.1 材料与方法
•     3.1.1 实验试剂
•     3.1.2 OfCCD1表达分析
•     3.1.3 电泳条件
•     3.1.4 数据分析
•   3.2 结果与分析
•     3.2.1 OfCCD1基因在不同花期的表达分析
•     3.2.2 OfCCD1基因在盛花中期不同时间的表达分析
•   3.3 小结与讨论
• 4 OfCCD1基因表达载体的构建及遗传转化
•   4.1 材料与方法
•     4.1.1 OfCCD1基因表达载体的构建材料
•     4.1.2 原核表达载体的构建
•     4.1.3 原核表达的蛋白表达与纯化
•     4.1.4 表达载体构建及检测
•     4.1.5 表达载体转化农杆菌
•     4.1.6 无菌苗的获得
•     4.1.7 转基因植株的获得
•     4.1.8 转基因植株的阳性检测
•   4.2 结果与分析
•     4.2.1 转基因植株统计
•     4.2.2 原核表达载体构建
•     4.2.3 诱导条件的优化
•     4.2.4 重组质粒诱导表达与表达形式鉴定
•   4.3 小结与讨论
• 5 结论与展望
• 6 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的主要学术成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 滕林佐

导师: 张党权

关键词: 桂花,类胡萝卜素,蛋白表达,表达模式

来源: 中南林业科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,园艺

单位: 中南林业科技大学

分类号: S685.13;Q943.2

总页数: 58

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