人乳头瘤病毒18型致癌蛋白E7的性质鉴定和单克隆抗体的筛选

论文摘要

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）主要感染人体皮肤和粘膜组织,引起增生性病变甚至恶性肿瘤。高危型别的HPV的长期感染是引发宫颈癌、肛门癌、头颈癌、口咽癌等恶性肿瘤的主要诱因。全球每年约57万宫颈癌新发病例,死亡病例高达31.1万例。目前宫颈癌的治疗手段有限,手术切除对人体伤害较大且有复发的风险,因此,开展HPV治疗性疫苗的研究刻不容缓。癌蛋白HPV E6和E7在肿瘤发生发展进程中起关键作用,被认为是干预和治疗的关键靶分子,因此对癌蛋白E6和E7的结构和功能展开深入的研究具有十分重要的意义。本研究分别利用原核表达系统和真核表达系统等多途径对HPV E6和E7蛋白的上清可溶性表达进行了探索,最终在pTO-T7载体上取得突破,经过密码子优化、表达菌株、洗脱条件和储存缓冲液等条件的探索和优化,克服了癌蛋白E7在原核表达系统中易聚集沉淀的难题,建立了一套稳定的表达纯化体系,获得了纯度90%以上、均一性和稳定性均良好的HPV18 E7蛋白,并对其展开了单克隆抗体的筛选,共获得55株与HPV18 E7蛋白具有良好反应性的单抗细胞株。本研究进一步对其中26株反应性优良的单抗细胞株展开抗体纯化和性质鉴定工作,包括抗体亚型、抗原抗体反应性、线性及构象和型特异性等。建立了HPV18 E7单抗盘,并且获得了1株反应性良好的型特异性构象抗体9A5、6株反应性良好的型特异性线性抗体（2E8、14E5、17F2、17F3、8A7、5C5、18E7和3B5）、1株反应性较弱的型特异性构象抗体（18E6）、6株两型交叉抗体（1A12、4A10、8E6、17A3、14A6和11E8）和1F6这株六型交叉线性抗体。综上,本研究建立了HPV18致癌蛋白E7可溶性表达和纯化体系,获得了高纯度且性质稳定的HPV18 E7蛋白并建立了单抗盘,为后续开展HPV18 E7蛋白结构解析、功能研究和治疗性疫苗或药物开发奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 前言
•   1 人乳头瘤病毒概况
•     1.1 HPV基因组
•     1.2 HPV早期蛋白的概述
•       1.2.1 E1蛋白
•       1.2.2 E2蛋白
•       1.2.3 E4蛋白
•       1.2.4 E5蛋白
•       1.2.5 E6蛋白
•       1.2.6 E7蛋白
•     1.3 HPV晚期蛋白的概述
•       1.3.1 L1蛋白
•       1.3.2 L2蛋白
•     1.4 HPV分型
•     1.5 HPV的感染历程
•     1.6 HPV的流行性病学研究
•   2 E6的结构与功能研究
•     2.1 E6的结构生物学研究
•     2.2 E6的生物学功能研究
•   3 E7的结构与功能研究
•     3.1 E7的结构生物学研究
•     3.2 E7的生物学功能研究
•   4 HPV疫苗研究进展
•     4.1 HPV预防性疫苗研究进展
•     4.2 当前HPV预防性疫苗的局限
•     4.3 HPV治疗性疫苗研究进展
•   5 本论文研究目的、思路与意义
• 第二章 材料与方法
•   1 材料
•     1.1 主要仪器设备
•     1.2 实验材料
•       1.2.1 E.coli菌株
•       1.2.2 质粒
•       1.2.3 细胞株
•       1.2.4 实验动物
•       1.2.5 酶
•       1.2.6 抗体
•       1.2.7 常用试剂
•       1.2.8 其他耗材
•     1.3 工作站和软件
•     1.4 常用溶液及试剂配制
•   2 方法
•     2.1 大肠杆菌表达系统的构建
•       2.1.1 目的序列的选取
•       2.1.2 引物设计
•     2.2 真核表达系统重组质粒的构建
•     2.3 蛋白表达和纯化方法（以pTO-T7-HPV-18 E7为例）
•       2.3.1 HPV-18 E7表达菌株的建立
•       2.3.2 工程菌的小量诱导表达
•       2.3.3 工程菌的大量诱导表达
•       2.3.4 AKTA色谱纯化分子筛层析
•     2.4 蛋白性质鉴定方法
•       2.4.1 SDS-PAGE和Western Blot分析蛋白大小和纯度
•       2.4.2 LC-MS/MS检测
•       2.4.3 高效液相色谱检测
•       2.4.4 AUC-SV检测方法
•       2.4.5 酶联免疫吸附反应检测抗原抗体的反应性
•       2.4.6 DSC（Differential Scanning Calorimetry）分析法
•     2.5 HPV-18 E7蛋白免疫动物实验
•     2.6 抗HPV-18 E7单克隆抗体的制备和筛选
•       2.6.1 杂交瘤细胞的获取
•       2.6.2 杂交瘤细胞的筛选
•       2.6.3 杂交瘤细胞的培养
•     2.7 抗HPV-18 E7单克隆抗体的初步性质鉴定
•       2.7.1 单抗腹水诱导
•       2.7.2 单抗纯化
•       2.7.3 蛋白免疫印迹分析单抗的构象性/线性
• 第三章 结果与分析
•   第一部分: HPV E6和E7蛋白表达与纯化研究
•     1.1 HPV E6和E7蛋白原核表达与纯化研究
•       1.1.1 MBP融合蛋白质粒构建及表达纯化
•       1.1.2 非保守半胱氨酸突变蛋白质粒构建及表达纯化
•       1.1.3 GST融合蛋白质粒构建及表达纯化
•       1.1.4 pTO-T7载体质粒构建及表达纯化
•     1.2 HPV E6和E7蛋白真核表达和纯化研究
•       1.2.1 三个真核表达系统的重组质粒构建及表达纯化
•       1.2.2 CHO表达系统质粒优化及表达鉴定
•     第一部分小结
•   第二部分: HPV18 E7-pTO-T7载体原核表达纯化条件的优化
•     2.1 HPV E6和E7基因序列密码子优化
•     2.2 HPV E6和E7蛋白镍亲和层析方案的优化
•     2.3 HPV18 E7蛋白存储缓冲液的优化
•     2.4 HPV18 E7蛋白凝胶过滤层析纯化
•     第二部分小结
•   第三部分: 原核表达HPV18 E7蛋白的理化性质研究
•     3.1 蛋白电泳、蛋白免疫印迹及肽指纹图谱分析HPV18 E7
•     3.2 高效液相色谱分析（HPLC）及分析型超速离心（AUC）检测样品均一性
•     3.3 差式扫描热量法（DSC）分析HPV18 E7蛋白热稳定性
•     第三部分小结
•   第四部分: 抗HPV18 E7单克隆抗体的制备及性质鉴定
•     4.1 HPV 18 E7单克隆抗体细胞株的筛选
•     4.2 HPV 18 E7单克隆抗体的制备与性质鉴定
•       4.2.1 单抗腹水制备与纯化
•       4.2.2 单抗与抗原反应性分析
•       4.2.3 单抗的亚型、线性及构象性质分析
•       4.2.4 单抗与各型别E6和E7的交叉反应性分析
•     第四部分小结
• 第四章 讨论
•   1 HPV E6和E7蛋白的可溶性表达
•   2 HPV18 E7抗体研究
•   3 HPV18 E7蛋白结构的研究
•   4 HPV18 E7致癌机制的研究
• 小结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录
•   在校期间发表成果
•   在校期间参与的科研项目

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王致萍

导师: 李少伟

关键词: 人乳头瘤病毒型,致癌蛋白,可溶性表达,单克隆抗体

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 厦门大学

分类号: R392

总页数: 127

文件大小: 9435K

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