基于生物反应器的效应细胞悬浮培养的初步探索以及无血清培养基的优化

论文摘要

体外扩增是解决治疗用细胞剂量不足问题的有效途径之一,它的影响因素主要来自于培养基和培养装置。为此,本文分别从培养基和培养装置两个角度优化细胞因子诱导杀伤细胞（Cytokine-induced killer,CIK）和造血干细胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）的体外扩增。本文首先通过正交实验确定葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸等单糖种类以及组合对CIK细胞体外扩增的影响,并进一步确定了最优添加剂量。结果显示,当2.2 mmol/L甘露糖、0.10 mmol/L葡萄糖醛酸组合使用时,体外培养CIK细胞14天后总细胞扩增倍数可达93.28±5.73,显著高于对照组的45.56±4.38（p<0.05）;而培养物中CD3+、CD3+CD56+、CD3+CD8+细胞的比例与对照组相当（p>0.05）,这三类细胞的扩增倍数分别可达到 269.40±59.98、473.4 7±112.37、453.38±91.43,显著高于对照组的127.12±21.86、177.12±23.79、226.93±21.66（p<0.05）,说明甘露糖和葡萄糖醛酸的联合应用可有效促进CIK细胞的扩增。且在该条件下扩增所得到的CD3+、CD3+CD8+细胞中表达颗粒酶B的细胞含量分别为（61.50± 17.11）%、（70.23± 18.05）%,CD3+、CD3+CD56+细胞中表达穿孔素的细胞含量分别为（77.00±7.50）%、（69.63±6.90）%,均显著高于对照组（p<0.05）;扩增14天后CIK细胞对K562细胞的杀伤活性为（35.77±10.79）%,也明显高于对照组的（22.27±6.16）%（p<0.05）,说明甘露糖和葡萄糖醛酸的联合应用可增强扩增后CIK细胞的肿瘤杀伤活性。造血干细胞主要富集于CD34+细胞中,本文以CD34+细胞为研究对象,尝试在体外建立适合CD34+细胞的悬浮培养体系。本文在初步评价CD34+细胞悬浮培养的可行性的基础上,以KG-1a细胞作为模型细胞,考察动态培养装置和搅拌模式对KG-la细胞体外扩增的影响。结果显示,在转瓶培养体系中采用摆锤式搅拌桨、搅拌转速控制为15 rpm更有利于KG-1a细胞扩增,并应用CD34+细胞加以验证,从而初步构建了CD34+细胞的体外悬浮培养体系。基于上述研究结果,进一步尝试探索了应用MINIFOR生物反应器培养CIK细胞的可能性。以上研究结果为CIK细胞和CD34+细胞的体外扩增技术的优化提供了技术支撑。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第1章 前言
•   1.1 细胞治疗
•     1.1.1 过继性免疫细胞治疗
•     1.1.2 干细胞移植
•   1.2 CIK细胞和造血干细胞体外扩增的影响因素
•     1.2.1 培养基成分
•     1.2.2 培养装置
•   1.3 本文的内容与意义
• 第2章 材料和方法
•   2.1 实验材料
•     2.1.1 血液
•     2.1.2 细胞
•     2.1.3 培养基
•     2.1.4 细胞因子
•     2.1.5 流式应用抗体
•     2.1.6 糖类
•     2.1.7 其他试剂
•   2.2 实验仪器与设备
•     2.2.1 常规设备
•     2.2.2 细胞培养器材
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 单个核细胞的分离
• +细胞的分离'>    2.3.2 CD34⁺细胞的分离
•     2.3.3 细胞培养
•     2.3.4 细胞计数
•     2.3.5 细胞表型分析
•     2.3.6 CIK细胞功能评估
•     2.3.7 DOE软件实验设计与分析
•     2.3.8 统计学分析
• 第3章 单糖种类对CIK细胞体外扩增特性的影响
•   3.1 无血清培养基中单糖种类对CIK细胞体外扩增的影响
•     3.1.1 单糖作用的初步验证
•     3.1.2 最优单糖组合的确定
•   3.2 最优单糖组合促进CIK细胞体外扩增的效果评估
•     3.2.1 CIK细胞扩增
•     3.2.2 CIK细胞功能
•   3.3 含有最优单糖组合的培养基的应用效果验证
•     3.3.1 采用T75方瓶验证含有最优单糖组合的培养基扩增CIK细胞的效果
•     3.3.2 采用细胞培养袋验证含有最优单糖组合的培养基扩增CIK细胞的效果
•   3.4 本章小结
• +细胞体外悬浮培养体系的建立'>第4章 CD34⁺细胞体外悬浮培养体系的建立
•   4.1 实验设计
•     4.1.1 培养体系均一化实验
•   4.2 结果与讨论
• +细胞悬浮培养的可行性分析'>    4.2.1 CD34⁺细胞悬浮培养的可行性分析
• +细胞体外悬浮培养体系的确立'>    4.2.2 CD34⁺细胞体外悬浮培养体系的确立
•   4.3 本章小结
• 第5章 生物反应器扩增CIK细胞的初步尝试
•   5.1 生物反应器的试运行
•   5.2 生物反应器中CIK细胞的体外扩增
•   5.3 本章小结
• 第6章 全文总结与展望
•   6.1 全文总结
•   6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻硕期间的主要学术成果
• 卷内备考表

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 卢意

导师: 蔡海波

关键词: 细胞,体外扩增,单糖,悬浮培养体系

来源: 华东理工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华东理工大学

分类号: Q813.11

DOI: 10.27148/d.cnki.ghagu.2019.000182

总页数: 79

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