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铁胁迫及强启动子A4插入对黄色链霉菌TRM45540次生代谢的影响

2020-12-10阅读(165)

铁胁迫及强启动子A4插入对黄色链霉菌TRM45540次生代谢的影响

论文摘要

黄色链霉菌Streptomyces luteus TRM45540分离自新疆罗布泊盐碱土壤,能够产生环肽类抗生素放线菌素D。本论文通过铁胁迫及插入强启动子A4两种手段,探讨黄色链霉菌TRM45540次生代谢的响应变化。研究发现高浓度硫酸亚铁胁迫下诱导黄色链霉菌高产放线菌素D。使用ISP4为发酵培养基,硫酸亚铁添加量为1000mg/L时,放线菌素D的产量相比硫酸亚铁正常添加剂量（1 mg/L）提高了52.06%。使用燕麦-豆粉最适产抗培养基进行发酵,高铁胁迫黄色链霉菌TRM45540放线菌素D的产量提高了56.47%,达到1013.36 mg/L。比较分析硫酸亚铁添加量为1 mg/L、100 mg/L、1000 mg/L时三个转录组样本的差异,推测并总结了硫酸亚铁胁迫下黄色链霉菌代谢响应规律。在高浓度亚铁离子胁迫下,首先激活卟啉相关的离子转运体系,将亚铁离子从细胞膜外运送至细胞膜内,同时消耗大量ATP,导致磷酸根离子匮乏,从而激活细菌双组份系统中SenX3-RegX3通路,调控放线菌素D的生物合成,同时激活了多烯类化合物沉默基因簇表达。通过大孔树脂吸附色谱、硅胶色谱、高效液相色谱分离纯化得到一个四烯类化合物,通过1D&2D NMR鉴定为JBIR-13。试验验证了磷酸根离子匮乏与高浓度硫酸亚铁胁迫对TRM45540次生代谢产物响应具有相同效果。此外,谷胱甘肽大量表达,通过螯合铁离子参与解毒代谢。通过将全局性强启动子A4随机整合在TRM45540基因组上提高了放线菌素D的产量。实验将强启动子A4整合到质粒pSET152中,转化到大肠杆菌,通过大肠杆菌与TRM45540的接合转移,得到的稳定接合子TRM45540::pYS001,接合子发酵产物中放线菌素D的产量相比出发菌株提高了26.85%。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第1章 文献综述
  •   1.1 放线菌素D的研究进展
  •     1.1.1 放线菌素D产生菌株简介
  •     1.1.2 放线菌素D的生物学活性
  •     1.1.3 优化菌株发酵放线菌素D产量研究进展
  •     1.1.4 放线菌素D的生物合成基因簇
  •   1.2 转录组测序与转录组应用简介
  •   1.3 铁营养胁迫及双组份系统简介
  •     1.3.1 微生物与铁营养简介
  •     1.3.2 双组分信号转导系统简介
  •   1.4 论文设计思路
  • 第2章 硫酸亚铁胁迫对放线菌素D代谢的影响
  •   2.1 材料与方法
  •     2.1.1 实验材料
  •     2.1.2 实验方法
  •   2.2 结果与分析
  •     2.2.1 不同浓度硫酸亚铁对放线菌素D产量的影响
  •     2.2.2 不同浓度络合剂对放线菌素D产量的影响
  •   2.3 小结与讨论
  • 第3章 铁胁迫下黄色链霉菌TRM45540转录组分析
  •   3.1 材料与方法
  •     3.1.1 菌株
  •     3.1.2 主要培养基表
  •     3.1.3 主要仪器和试剂
  •     3.1.4 转录组测序
  •     3.1.5 转录组样本的准备
  •     3.1.6 总RNA的提取及检测
  •     3.1.7 文库构建及RNA测序
  •     3.1.8 生物信息学分析
  •     3.1.9 测序数据质量评估
  •     3.1.10 KEGG通路分析
  •     3.1.11 验证试验的设计
  •     3.1.12 放线菌素D合成途径相关基因分析
  •   3.2 结果与分析
  •     3.2.1 RNA样品质量检测结果
  •     3.2.2 转录组测序原始数据数据分析
  •     3.2.3 差异表达基因分析
  •     3.2.4 与放线菌素D产量相关代谢通路验证
  •   3.3 小结与结论
  • 第4章 铁胁迫下黄色链霉菌TRM45540次生代谢产物分离与鉴定
  •   4.1 材料与方法
  •     4.1.1 菌株
  •     4.1.2 培养基种类和成分
  •     4.1.3 主要仪器和试剂
  •     4.1.4 发酵产物的预处理
  •     4.1.5 发酵产物分析
  •     4.1.6 TRM45540次生代谢产物分离与鉴定
  •   4.2 结果与分析
  •     4.2.1 铁胁迫发酵TRM45540次生代谢产物的 HPLC 分析
  •     4.2.2 TRM45540次生代谢产物的分离与结构鉴定
  •   4.3 小结与讨论
  • 第5章 强启动子A4促进黄色链霉菌高产放线菌素D
  •   5.1 材料与方法
  •     5.1.1 菌株、质粒和培养基
  •     5.1.2 主要仪器和试剂
  •     5.1.3 DNA片段回收
  •     5.1.4 大肠杆菌 Escherichia coli S17-1感受态的制备及 DNA 转化
  •     5.1.5 质粒DNA的提取：
  •     5.1.6 转化子的构建
  •     5.1.7 转化子的验证
  •     5.1.8 接合子的构建
  •     5.1.9 接合子的总DNA提取
  •     5.1.10 发酵培养流程
  •   5.2 结果与分析
  •     5.2.1 PCR及酶切验证转化子pYS001的正确性
  •     5.2.2 接合子TRM45540::pYS001的PCR验证
  •     5.2.3 TRM45540::pYS001与野生型TRM45540菌株发酵比较
  •   5.3 小结与讨论
  • 第6章 总结与展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 杨帅

    导师: 万传星

    关键词: 黄色链霉菌,放线菌素,铁胁迫,转录组,强启动子

    来源: 塔里木大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 塔里木大学

    基金: 国家自然科学基金地区基金项目“种间竞争和铁营养胁迫下易变链霉菌抗生素和铁载体代谢的化学响应机制研究”的部分研究成果(项目编号:31460138),课题负责人:万传星教授和“微生物资源利用兵团重点领域创新团队”的部分研究成果(项目编号:2017CB014),课题负责人:万传星教授(塔里木大学)

    分类号: Q935

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