小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1对Sox30基因表达调控的研究

论文摘要

目的:雄性生殖细胞从具有有丝分裂活性的原始生殖细胞发育为成熟精子的过程被称为精子发生。精子发生起源于精原干细胞,分为精原细胞的有丝分裂期、精母细胞的减数分裂期和精子形成期三个阶段。精原细胞经历有丝分裂后在精子形成期发生一系列复杂的结构重塑最终形成成熟精子。许多与精子形成期相关的基因在雄性生殖细胞发育的早期如精原细胞中已经开始转录,此时转录的m RNA在细胞发育至后期时才被翻译为蛋白质并发挥功能。精卵发生特异表达螺旋-环-螺旋转录因子1（Spermatogenesis-and oogenesis-specific b HLH transcription factor-1,Sohlh1）在雄性生殖细胞中主要表达于A1-A4型精原细胞,编码蛋白含有一个b HLH结构域,可以形成异二聚体或同型二聚体与DNA上的E-box序列CANNTG结合调控下游基因的表达。本课题组前期研究发现Sohlh1基因敲除雄性小鼠不育,精原细胞发育及分化异常导致进入减数分裂的精母细胞减少,无成熟精子产生。基因芯片检测结果显示出生后7天野生型雄鼠与Sohlh1基因敲除雄鼠睾丸组织中Sox30、Rnf17等精子发生中关键基因均出现表达差异,推测SOHLH1可能直接或间接调控Sox30基因转录。Sox30是Sox家族H亚族唯一的成员,编码蛋白具有一个HMG box结构域,与性腺发生和精子发生有关。Sox30基因敲除雄性小鼠无生育能力,圆形精子细胞核表面没有参与顶体形成的顶体颗粒,说明精子发生阻滞于精子形成期,推测Sox30可能与精子发生中的顶体形成相关,现阶段并无转录因子调控Sox30表达的报道。SOHLH1主要表达于精子发生早期的分化型精原细胞,有研究发现Sox30的m RNA在精母细胞中存在转录并持续存在,但SOX30蛋白最早出现于精子发生后期的圆形精子细胞中,我们通过生物信息学预测发现Sox30基因上游存在SOHLH1转录因子结合序列,推测Sox30基因有可能受SOHLH1转录调控。正常Sox30m RNA具有完整的HMG结构域和C端结构域,但Sox30 m RNA变异体缺少完整的C端结构域,研究显示C端结构域与m RNA的延时翻译现象相关。本研究拟通过分析野生型小鼠和Sohlh1-/-小鼠雄性生殖细胞中Sox30基因m RNA的转录情况,初步探索Sox30基因在雄性生殖细胞中的表达模式和精原细胞早期发育相关的重要转录因子SOHLH1参与精子发生后期相关基因Sox30的转录调控机制,并进一步筛选Sox30基因启动子序列上SOHLH1特异性结合位点的DNA序列。研究方法:将野生型C57BL/6J雄鼠和Sohlh1基因敲除雄鼠作为本实验的研究对象,通过q RT-PCR实验检测PD7（出生后7天）和成年小鼠睾丸组织RNA中Sox30 m RNA不同转录本的表达水平;通过构建Sox30启动子表达载体和双荧光素酶报告基因研究SOHLH1对Sox30启动子序列的转录调控作用;通过Ch IP实验筛选SOHLH1在Sox30启动子序列上的主要结合位点。结果:q RT-PCR实验结果显示,与出生后7天的野生型C57B6L/J小鼠相比,Sohlh1-/-小鼠睾丸组织中,Sox30 m RNA表达量显著下调（P<0.01）,Sox30 m RNA变体表达量下调（P<0.05）。与成年野生型C57B6L/J小鼠相比,Sohlh1-/-小鼠中Sox30 m RNA表达量显著下调（P<0.01）,此时其m RNA变体表达量上调（P<0.01）,由于Sohlh1基因缺失导致Sox30的两个转录本表达量均出现异常,成年Sohlh1-/-小鼠中Sox30 m RNA变异体出现了异常转录并累积的现象。双荧光素酶实验结果显示,将Sohlh1真核表达质粒与启动子荧光表达载体共转染时,Sox30启动子上游-876 bp的区域内的荧光活性最强,推测核心启动子片段位于该片段内,生殖细胞特异表达转录因子SOHLH1可以激活Sox30基因的转录。Ch IP实验结果显示,转录因子SOHLH1可以结合于Sox30转录起始位点上游-544 bp E-box（CAACTG）、-489 bp E-box（CAGGTG）、-166 bp E-box（CAACTG）、-101 bp E-box（CATATG）这四个E-box位点,但与-489 bp（CAGGTG）位置的E-box位点结合作用较强,此E-box位点为Sox30基因启动子上的主要转录激活位点。结论:1、转录因子SOHLH1对睾丸组织特异表达基因Sox30的表达具有转录激活作用,SOHLH1对Sox30的转录激活证明该基因存在延时翻译的现象。2、在小鼠睾丸中,转录因子SOHLH1能够结合于Sox30基因转录起始位点上游-544 bp、-489 bp、-166 bp和-101 bp E-box结构域,对Sox30起转录激活作用,并且位于-489 bp（CAGGTG）位置的E-box位点与转录因子SOHLH1的结合作用较强,此E-box位点为Sox30基因启动子上的主要转录激活位点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略语
• 1 前言
• 2 材料与方法
•   2.1 主要试剂和仪器
•     2.1.1 实验动物
•     2.1.2 主要试剂
•     2.1.3 主要仪器
•   2.2 技术路线
•   2.3 实验方法
•     2.3.1 Sohlh1 基因敲除与野生型小鼠基因型鉴定
•     2.3.2 出生后7 天和成年的Sohlh1 KO与 WT小鼠睾丸组织RNA提取
•     2.3.3 RNA反转录为cDNA
•     2.3.4 Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）检测Sox30 mRNA及 Sox30 mRNA变异体的表达水平
•     2.3.5 数据统计分析
•     2.3.6 Sox30 基因转录起始位点上游的SOHLH1 结合位点分析
•     2.3.7 Sox30 基因启动子片段荧光载体构建方案和启动子目的片段扩增引物设计
•     2.3.8 构建Sox30 启动子全长和启动子截短序列的pMD18-T-Sox30质粒
•     2.3.9 构建Sox30 启动子全长和启动子截短序列的pGL3-Basic质粒
•     2.3.10 双荧光素酶报告基因系统检测SOHLH1对Sox30 启动子活性的影响
•     2.3.11 染色质免疫共沉淀（ChIP）实验和qRT-PCR验证结合位点
•     2.3.12 Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）检测Rnf17 mRNA的表达水平
•     2.3.13 数据统计分析
• 3 结果
•   3.1 PCR实验鉴定Sohlh1 KO与 WT小鼠基因型
•   3.2 qRT-PCR实验检测Sohlh1 基因敲除小鼠中Sox30 mRNA的表达水平
•   3.3 构建pGL3-Sox30 启动子区域荧光素酶报告质粒
•   3.4 双荧光素酶实验验证转录因子SOHLH1对Sox30 基因启动子区的转录调节作用
•   3.5 ChIP实验筛选转录因子SOHLH1与Sox30 基因启动子区的主要结合位点
•   3.6 qRT-PCR实验检测Sohlh1 基因敲除小鼠中Rnf17 的表达水平
• 4 讨论
• 5 结论
• 本研究创新性的自我评价
• 参考文献
• 综述
•   参考文献
• 攻读学位阶段取得的研究成果
• 致谢
• 个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 齐婉婧

导师: 郑志红

关键词: 转录后调控,精子发生

来源: 中国医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 中国医科大学

基金: 辽宁省科技计划项目(No. 2015408002)

分类号: Q78

DOI: 10.27652/d.cnki.gzyku.2019.001371

总页数: 67

文件大小: 3761K

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